Mutagénesis insercional de la proteína VP6 de rotavirus. Caracterización y utilización como carrier de epitopes

PERALTA ANDREA; MOLINARI PAULA; TABOGA OSCAR

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología

El objetivo general del proyecto es evaluar el empleo de partículas semejantes a virus (VLPs) basadas en la proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos. Esta proteína es capaz de autoensamblarse en partículas esféricas y láminas tanto en su forma nativa como expresada como proteína recombinante. Con el objeto de investigar los posibles sitios de inserción de secuencias foráneas en la proteína VP6, se eligió el epitope V5 derivado del paramixovirus SV5. Mediante la utilización de algoritmos que permiten analizar la hidrofilicidad de una proteína y los sitios expuestos al solvente, se seleccionaron seis posibles sitios de inserción de epitopes foráneos, correspondientes a las posiciones aminoacídicas 14, 101, 146, 235, 382 y la posición N-terminal. A través de mutagénesis dirigida por PCR se insertó un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI en la secuencia de VP6 que permitió el clonado posterior del epitope foraneo V5, originando así las distintas versiones VP614, VP6101, VP6146, VP6235, VP6382  y VP6Nterm. Las proteínas quiméricas fueron expresadas en el sistema baculovirus-células de insecto y se obtuvieron altos niveles de expresión para todas las versiones ensayadas. Los extractos proteicos fueron analizados mediante ensayos de Western blot (en condiciones no reductoras) y ultracentrifugaciones en gradientes de sacarosa. Además, se realizó un ensayo de inmunización en ratones, que recibieron 5ug de proteína quimérica por vía i.p. La versión VP614 no es reconocida por un suero policlonal anti-VP6, mientras que sí lo es por un anticuerpo monoclonal anti-V5, indicando que mediante la inserción se está interrumpiendo un sitio antigénico importante de la proteína VP6. La inserción de un epitope en la posición aminoacídica 235 impide la trimerización de VP6, mientras que la inserción en la posición 382 afecta su multimerización. La inmunización de ratones con estas quimeras en su forma monomérica, generó una respuesta humoral específica contra el epitope V5 que variaba según la quimera utilizada en la inmunización. Las mejores versiones resultaron ser la 146 y la 235, mientras que 382 no despertó una respuesta inmune contra el epitope V5. Todas las versiones generaron una respuesta similar contra la proteína carrier, señalando que las diferencias observadas en la respuesta contra el epitope V5 se debe a la posición de éste en la secuencia lineal de la proteína VP6. Dada la alta prevalencia de rotavirus a campo, se decidió evaluar el efecto de anticuerpos contra VP6 previos a la inmunización con las quimeras VP6/V5. Se observó que una respuesta humoral preexistente contra el carrier actúa de manera positiva en la inducción de anticuerpos anti-epitopeV5.   Se caracterizó la proteína VP6 mediante mutagénesis insercional. La posición aminoacídica 14 resultó ser un sitio antigénico importante. La inserción de un epitope en la posición aminoacídica 235 impide la trimerización de VP6, mientras que la inserción en la posición 382 afecta su multimerización. Al utilizar las quimeras VP6/V5 como inmonógenos se obtuvo una respuesta humoral específica contra el epitope V5 que dependía de la posición de éste en la proteína carrier.