Larvas de insecto como biofábricas de VLPs (Virus like particles)

MOLINARI PAULA; PERALTA ANDREA; TABOGA OSCAR

Vaquerías, Prov de Córdoba

Jornada; XXVI Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2006

Sociedad Argentina de Virología

El desarrollo de carriers particulados como ser las partículas tipo virus (VLPs-virus like particles) constituyen una herramienta muy útil en el desarrollo de vacunas de nueva generación. En particular, se han estudiado VLPs basadas en las proteínas L1 y L2 de paplilomavirus humano como vacunas para prevenir el cáncer de cuello de útero y en proteínas de rotavirus como vacunas para prevenir diarreas bovinas y humanas. Habitualmente, estas VLPs son producidas in vitro en el sistema baculovirus-células de insecto. El costo de producción de las vacunas veterinarias es un punto importante a tener en cuenta en el desarrollo de las mismas. El objetivo de este trabajo es evaluar la producción de partículas tipo virus en larvas de Spodoptera frugiperda infectadas con baculovirus recombinantes. Se inyectaron larvas del cuarto estadio intracuticularmente con baculovirus recombinantes para las proteínas VP2 y VP6 de rotavirus (AcVP2 y AcVP6). A los 4 días post infección (dpi), las larvas fueron sacrificadas, se colectó la hemolinfa y se extrajeron las proteínas intracelulares mediante detergentes y DTT. El clarificado de la hemolinfa y del extracto de las larvas se ultracentrifugó 90 min a 46000g sobre un colchón de sacarosa 30-60%. Con el material de la interfase se realizó un gradiente de CsCl RI 1.367 (157000 g, 18 hs), que posteriormente fue separado en  tres fracciones de 1ml que se concentraron por ultracentrifugación. Se comprobó la expresión y la identidad de las dos proteínas recombinantes VP2 y VP6 tanto en el cuerpo de la larva como en la hemolinfa por ensayos de Western blot revelados con sueros murinos anti rotavirus y con un anticuerpo monoclonal anti VP2. Sólo el material contenido en la hemolinfa fue capaz de atravesar un colchón de sacarosa 30%, que localizó en la fracción media del gradiente de CsCl. La identidad de estas proteínas se corroboró nuevamente por Western blot. Finalmente, se confirmó por microscopía electrónica el ensamblado de VLPs formadas por una capa interna constituida por VP2 y una externa formada por VP6. Las VLPs obtenidas a partir de la hemolinfa de larvas resultaron idénticas en cuanto a morfología y tamaño a las VLPs obtenidas a partir de cultivo de células Sf9.  En este trabajo pudieron ser coexpresadas dos proteínas constituyentes de las cápside de rotavirus (VP2 y VP6) en larvas de Spodoptera frugiperda, las mismas conservaron la propiedad de autoensamblarse formando partículas tipo virus y se concentraron en la hemolinfa, facilitando su purificación y reduciendo enormemente los costos de producción.