Diseño de VLPs quiméricas como móleculas multiméricas presentadoras de epitopes heterólogos

PERALTA ANDREA; MOLINARI PAULA; TABOGA OSCAR

Paseo La PLaza, Ciudad de Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virología

Las partículas semejantes a virus (VLPs) están formadas por proteínas de origen viral capaces de autoensamblarse y formar estructuras particuladas al ser expresadas en sistemas heterólogos, aún en ausencia de otros componentes virales. Las VLPs son consideradas un sistema seguro de presentación de antígenos heterólogos, ya que carecen de genoma viral, no replican y no son infecciosas. Debido a su estructura espacial, los sitios antigénicos son presentados al sistema inmune de manera multimérica, asociados a proteínas inmunogénicas. Estas partículas quiméricas muestran cantidades pronunciadas de determinantes antigénicos, en particular aquéllos de naturaleza conformacional, y presentan una ventaja decisiva respecto de las proteínas monoméricas. La proteína VP6, que forma la cápside media de los rotavirus, es capaz de autoensamblarse y formar VLPs tanto en su forma nativa como cuando es expresada en forma de proteína recombinante en el sistema baculovirus-células de insecto. En base a los datos cristalográficos de la proteína VP6 y mediante el análisis de los mismos con el visualizador WebLab, se seleccionaron como sitios blanco de inserción de secuencias heterólogas, la posición aminoacídica 171 (forma parte de un loop levemente expuesto en la cápside de los rotavirus) y el loop 301/308. A través de mutagénesis dirigida por PCR se insertó un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI en la secuencia de VP6 que permitió el clonado posterior de un epitope de 14 aminoácidos derivado del paramixovirus SV5, originando así las versiones VP6171-V5 y VP6301/8-V5. Estas quimeras fueron expresadas en el sistema  con baculovirus-células de insecto y se determinaron los niveles de expresión alcanzados, su capacidad de trimerización, su capacidad de multimerización, sus propiedades antigénicas, su interacción con la proteína VP2 y su inmunogenicidad en animales de laboratorio. La inserción del epitope V5 en las posiciones 171 y 301/8 afectó la formación de trímeros pero no así la capacidad de formar multímeros junto con la proteína VP2. La caracterización estructural de estos multímeros, mediante gradientes de CsCl, microscopía electrónica y ensayos de ELISA sandwich reveló que la inserción del epitope V5 en la posición 171 de VP6 produce VLPs quiméricas estables y que exponen el epitope heterólogo en su superficie. La inmunización de ratones por vía i.p. con VLPs quimérica VP6171-V5 +VP2 resultó en la inducción de una sólida respuesta humoral contra el epitope V5 aún utilizando sólo 30ng de proteína quimérica, mientras que la inmunización con 5ug de la misma quimera VP6171-V5 pero en su estado monomérico indujo una respuesta humoral contra el epitope V5 apenas detectable, demostrando la ventaja de utilizar un carrier multimérico. Los resultados obtenidos permitieron identificar sitios de inserción de secuencias heterólogas que pueden utilizarse en la producción de VLPs quiméricas capaces de inducir sólidas respuestas inmunes humorales contra el epitope transportado, a dosis muy bajas.