INVESTIGADORES
NUSBLAT Alejandro David
congresos y reuniones científicas
Título:
Interferencia con ARN por alimentación en el ciliado Tetrahymena thermophila aplicada a la identificación de desaturasas de esteroles.
Autor/es:
SEBASTIÁN R. NAJLE; ALEJANDRO NUSBLAT; CLARA NUDEL; ANTONIO D. UTTARO
Lugar:
Santa Fe, Argentina
Reunión:
Congreso; XXIII Reunión Científica Anual, Sociedad Argentina de Protozoología; 2009
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Protozoologia
Resumen:
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Interferencia con
ARN por alimentación en el ciliado Tetrahymena
thermophila aplicada a la identificación de desaturasas de esteroles.
Sebastián R. Najle1, Alejandro Nusblat2,
Clara Nudel2 y Antonio D. Uttaro1
1 Departamento de Microbiología. Instituto de Biología Molecular y
Celular de Rosario (IBR-CONICET). Suipacha 531. S2002LRK, Rosario. Argentina.
2 Cátedra
de Biotecnología y Microbiología Industrial, Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Universidad de Buenos Aires, Junín 956, 1113 Buenos Aires, Argentina.
Los ciliados del
género Tetrahymena son protozoos de
vida libre que habitan suelos, arroyos, lagunas y estanques. Son células
grandes, de 40 a
50 mm a lo largo de su eje
antero-posterior, con unas 1000 cilias ordenadas principalmente en filas
longitudinales. La organización genómica de los ciliados es inusual ya que
presentan dualismo nuclear. Estos microorganismos constituyen un excelente
sistema biológico para el estudio de varios aspectos de la bioquímica de
membranas. Las membranas de T. thermophila
contienen un único alcohol triterpenoide pentacíclico, el tetrahymanol, que el
microorganismo es capaz de sintetizar mediante la ciclación del escualeno
producido a través de la vía del ácido mevalónico. El tetrahymanol se localiza
principalmente en las membranas limitantes del organismo y su función parece
ser similar a la de los esteroles en las membranas de organismos superiores. A
pesar de no poseer esteroles sintetizados endógenamente, Tetrahymena
tiene la capacidad de incorporar esteroles existentes en el medio y
modificarlos produciendo pro-vitaminas D. En el caso de los esteroles de la
serie colestan, los mismos son
convertidos principalmente en 7, 22-bis
dehidrocolesterol mediante una serie de desaturaciones en las posiciones C5(6),
C7(8) y C22(23). Esta capacidad de biotransformación de esteroles tiene un
claro interés biotecnológico ya que el 7-dehidrocolesterol es la provitamina
D3, y la eventual aplicación de esta actividad enzimática en la constitución de
alimentos funcionales de origen animal tendría el doble efecto de la reducción
del contenido de colesterol con el concomitante enriquecimiento en provitamina
D3. A pesar del gran desarrollo de herramientas genéticas y de biología
molecular utilizables en T. thermophila existe
una serie de restricciones prácticas para su aplicación: 1) el genoma de este
organismo es muy rico en A+T lo que torna muy trabajosa su amplificación por
PCR; 2) los codones UAA
y UAG, que son codones de terminación en otros organismos, codifican aquí
Glutamina (Q) dificultando la expresión heteróloga de genes; 3) las células
deben encontrarse
en conjugación para ser competentes para la electroporación. Las células
vegetativas pueden transformarse por bombardeo biolístico o, con mucha menor
eficiencia, por microinyección directa del macronúcleo. Debido a estas
dificultades se decidió poner a prueba la técnica de interferencia con ARN por
alimentación con bacterias que sobre-expresan ARNs de doble hebra. Esta técnica
fue desarrollada para el nemátodo Caenorhabditis
elegans, y posteriormente fue aplicada con éxito en otros organismos
incluyendo nemátodos parásitos e incluso ciliados de otros géneros, pero nunca
antes fue empleada sobre Tetrahymena.
El empleo de esta sencilla técnica de genética reversa permitió identificar una
oxidasa con dominio Rieske que estaría involucrada en la conversión de
esteroles en derivados D7 insaturados, convirtiendo el colesterol en provitamina D3.