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Identificación de genes del metabolismo de esteroles en el ciliado Tetrahymena mediante análisis bioinformatico y noqueo somático. A. D. Nusblat1, M. L. Tomazic1, S. R. Najle2, M. A. Rinaldi1, A. D. Uttaro2 y C. B. Nudel1. 1 Cátedra de Biotecnología y Microbiología Industrial, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, 1113 Buenos Aires, Argentina. 2 Departamento de Microbiología. Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR-CONICET). Suipacha 531. S2002LRK, Rosario. Argentina. Las enzimas que intervienen en el metabolismo de esteroles se encuentran ampliamente distribuidas y presentan estructuras primarias altamente conservadas. Los intermediarios y productos de estas vías modulan la fluidez de membranas y cumplen funciones metabólicas y de señalización. intra e intercelular en todos los organismos eucariotas. No todos los organismos poseen las enzimas intervinientes de la vía completa de síntesis de esteroles. Este es el caso de organismos invertebrados como nematodos e insectos y varios protozoarios como los ciliados. El requerimiento de esteroles entre los ciliados es irregular. Por ejemplo, Paramecium tetraurelia requiere esteroles para su desarrollo vegetativo. En cambio Tetrahymena satisface este requerimiento sintetizando hopanoides (símil esteroles encontrados en bacterias), principalmente el tetrahymanol, con el que regula la fluidez y permeabilidad de las membranas, en conjunto con los ácidos grasos. La capacidad de ciertos ciliados de sintetizar y usar hopanoides puede ser una reliquia metabólica, remanente de los tiempos en que la atmósfera era anaerobia, ya que, a diferencia de los esteroles, su síntesis no requiere oxigeno molecular. Si bien Tetrahymena carece de la capacidad de sintetizar esteroles, cuando estos se agregan en el medio de cultivo se interrumpe inmediatamente la síntesis de tetrahymanol y el esterol adicionado es incorporado y, en ciertos casos, también modificado. Se han detectado cuatro tipos de modificaciones posibles: la introducción de dobles enlaces en posiciones C5(6), C7(8) y C22(23) y la remoción del grupo etilo del carbono 24. Ninguna de las enzimas responsables de estas transformaciones han sido aisladas. A partir de una caracterización preliminar de las actividades C7(8) y C22(23) esterol desaturasas, en fracciones microsomales, se determinaron sus requerimientos de oxigeno, NAD(P)H y Cytb5. La búsqueda informática de un consenso de esterol desaturasas Cytb5 dependientes reveló 8 genes putativos en el genoma de Tetrahymena. El análisis de las hipotéticas secuencias proteicas las agrupa dentro de la superfamilia de hidroxilasas de ácidos grasos, que incluyen las C5 esterol desaturasas, C4 metil oxidasas y C4 esfingolipido hidroxilasas. Estas enzimas tienen motivos conservados de histidina y son proteínas integrales de membrana. Con el fin de identificar los genes responsables del metabolismo de esteroles en Tetrahymena thermophila se procedió a generar mutantes mediante noqueo somático por precombinación homologa. Para ello se realizaron construcciones por overlapping PCR, consistentes en un gen marcador seleccionable y regiones homologas flanqueantes de cada uno de los genes a noquear. De esta forma se pudo identificar dos de estos genes como correspondientes a C5(6) esterol desaturasa y C24 esterol deeetilasa. La caracterización de las mutantes noqueadas revelo aspectos muy distintos de ambos genes. Mientras que la mutante noqueada en C5(6) no tiene ningún fenotipo apreciable ni se afecta su crecimiento, tanto en rendimiento de biomasa como velocidad de crecimiento, la mutante noqueada en la actividad deetilasa sufre significativos cambios en ambos parámetros, también visibles en la morfología aparente. Ambas mensajeros se transcriben en ausencia de esteroles, según indicaron los ensayos de RT-PCR. Tampoco seria necesario la instauración en C7(8) para la introducción del doble enlace en C5, a diferencia de lo observado en otros eucariontes analizados. Estos son los primeros dos genes del metabolismo de esteroles identificados en ciliados. Mas aun, el gen correspondiente a la enzima deetilasa no ha sido encontrada en ningún organismo.

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