Dinámica evolutiva del virus de la hepatitis C en infecciones con múltiples genotipos

CULASSO ANDRÉS; BARÉ PATRICIA; CAMPOS RODOLFO

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología 2008; 2008

Sociedad Argentina de Virología- Asociación Argentina de Microbiología

El uso de factores de coagulación de origen humano permitió al Virus de la Hepatitis C (HCV) aumentar su incidencia en la población de pacientes hemofílicos. Debido a su condición, dichos pacientes, reciben cuidados constantes y se cuenta con muestras de plasmas recolectadas para diversas finalidades. Este archivo permite realizar estudios retrospectivos sobre pacientes crónicos superinfectados con múltiples genotipos. El estudio de este tipo de infecciones permite evaluar la persistencia encubierta de genotipos más refractarios al tratamiento (1 y 4) Materiales y MétodosMuestras: Se analizaron 11 muestras que correspondían a los siguientes meses y años: 02/1993, 10/1995, 03/1997, 01/1998, 11/1998, 07/1999, 03/2000, 10/2001, 02/2002, 09/2004 y 10/2006.Retrotranscripción y Reacción en cadena de la Polimerasa RT-PCR: Se extrajo el ARN de los plasmas con un kit comercial. Se realizó retrotranscripición con Random Primers. Se amplificaron por PCR nested las regiones 5’ no codificante (5’UTR), NS5B, NS5A y E2 (nucleótidos (nt) 1398 a 1972 en AF009606, genotipo 1a y nt 1457 a 2050 en D00944, genotipo 2a) incluyendo las regiones hipervariables 1, 3 y 2 (HVR-1, 3 y 2) y una región putativa de unión al receptor celular CD81.Genotipificación: Se realizó por análisis de los patrones de restricción enzimática de 5’UTR. Se subtipificó por secuenciación directa de la región NS5B. Los datos de secuencia se analizaron con el programa MEGA 4 junto con secuencias de referencia.Análisis de Secuencias: Las secuencias obtenidas fueron alineadas con el programa ClustalX. Se buscaron los mejores árboles por el método de maximun likelihood utilizando el modelo sugerido por el programa ModelTest con el paquete PAUP* para Windows. Las tasas de sustitución de nucléotidos se estimaron con el programa BEAST.ResultadosLa genotipificación por 5’UTR permitió detectar en las muestras del 1993 al 1999 los genotipos 1, 2 y 3 en diversas combinaciones. Las muestras posteriores al año 2000 resultaron genotipo 2. La muestra de 2004, correspondiente al final de tratamiento con peg-Interferon, resultó negativa. Los subtipos fueron confirmados por análisis filogenético de NS5B como 1a, 2a y 3a.El análisis de la región NS5A a partir de 11 secuencias permitió caracterizar a 2 (1997 y 01/1998) como genotipo 1a y 9 como genotipo 2a (todas a excepción de 1995 y 2004). Para estas últimas se estimó una tasa de 1,6×10-3 sustituciones por sitio por año observándose un árbol compatible con acumulación de mutaciones.Región E2: Se secuenciaron 4 muestras para genotipo 1a: 1995 a 11/1998. Se observó un proceso de acumulación de mutaciones a lo largo de todo el fragmento, estimándose una tasa de 1,4×10-3 sustituciones por sitio por año. Para el genotipo 2a se obtuvieron 6 secuencias (muestras 11/1998 en adelante). Las mutaciones se concentraron sobre la HVR1. Las estimaciones de las tasas de sustitución de nucleótido por sitio por año fueron de 3,2×10-2 para la HVR1 y de 2×10-3 para el resto de E2. La inspección de las secuencias de aminoácidos sugiere que en la HVR1 opera un mecanismo de salto de poblaciones, mientras que la región de interacción a CD81 se observa una acumulación de mutaciones. En una coinfección con múltiples genotipos, la preponderancia de cada uno de ellos es variable con el tiempo. En el presente estudio se observó evidencia de tres mecanismos evolutivos: a.- Deriva Génica (drift) Acumulación de mutaciones en principio neutras, como se observó en los fragmentos NS5A de genotipo 2a y E2 de genotipo 1a. b.- Salto de poblaciones (shift) observada como una rápida evolución de la HVR1 del genotipo 2a, c.- Selección: Acumulación de mutaciones no clasificables como neutrales y posiblemente relacionadas, en la región de unión a CD81 celular del fragmento E2 de genotipo 2a.