Caracterización de proteínas insecticidas binarias Vip1/Vip2 de la cepa nativa Bacillus thuringiensis INTA Fr7-4

PEDARROS ANALÍA; NAVAS LAURA; LEIVA CARLOS; CHACANA PABLO; ALFONSO VICTORIA; TABOGA OSCAR; SAUKA DIEGO; BERRETTA MARCELO; BENINTENDE GRACIELA

Congreso; IV Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2018

Algunas cepas de Bacillus thuringiensis producen proteínas insecticidas solubles, secretadas durante la fase vegetativa, conocidas como proteínas Vip (vegetative insecticidal proteins). Las proteínas Vip1 y Vip2 son componentes de una toxina binaria con toxicidad específica contra coleópteros. En un trabajo previo, obtuvimos la secuencia del genoma de la cepa B. thuringiensis INTA Fr7-4 y reportamos la presencia de un megaplásmido (pFR260) conteniendo genes codificantes de proteínas coleoptericidas, asociados en una isla de patogenicidad, en particular dos pares de genes vip1/vip2. En este trabajo, analizamos el patrón de expresión de estos genes y la funcionalidad del componente Vip2. En el plásmido pFR260 cada par de genes vip1/vip2 se dispone en tándem formando un operón. La secuencia que codifica la porción secretada de cada Vip de uno de los operones (operón 04) se clonó en un vector para su expresión en Escherichia coli, obteniéndose productos de los pesos moleculares esperados. Vip2(04) se obtuvo como proteína soluble mientras que Vip1(04) se obtuvo como cuerpos de inclusión. Se produjeron anticuerpos contra ambos tipos de proteínas, los cuales se utilizaron en ensayos de inmunoblot para estudiar la cinética de expresión de las mismas en cultivos de la cepa INTA Fr7-4. Se observó un nivel de acumulación de ambos tipos de proteínas en el sobrenadante del cultivo en fase estacionaria temprana, siendo menor en medio específico para esporulación. Asimismo, se evaluó la toxicidad de cultivos de INTA Fr7-4 en fase estacionaria temprana para larvas neonatas del picudo del algodonero, Anthonomus grandis (Coleoptera). Los sobrenadantes de cultivo evidenciaron niveles moderados de toxicidad (27%), mientras que los mismos se duplicaron (62%) utilizando el cultivo completo en los bioensayos.La toxicidad de Vip1/2 en los insectos susceptibles depende de la unión específica de Vip1 a la célula intestinal y su mediación en la translocación de Vip2 al interior de la célula, donde esta última inhibe la polimerización de la actina. Para analizar la actividad de Vip2(04), transfectamos un plásmido que expresa la proteína en células de insecto Sf9, a su vez infectadas con un baculovirus AcMNPV marcado con GFP. Dado que la replicación viral requiere la integridad del citoesqueleto de actina, la falta de propagación del virus en las células transfectadas evidenció, en forma indirecta, la actividad inhibitoria de Vip2(04) en la polimerización de la actina.