Papel de los ácidos nucleicos citoplasmáticos de los baculovirus en la producción de IFN-I en células no inmunes de mamífero

AMALFI SABRINA; MOLINA GUIDO NICOLÁS; TABOGA, OSCAR; ALFONSO VICTORIA

Salta

Jornada; XI Jornadas y Reunión Anual de la Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria; 2018

Asociación Argentina de Inmunología Veterinaria

Los baculovirus (BV) son virus envueltos de ADNdc patógenos de insectos. En mamífero presentan un ciclo viral no productivo generando la posibilidad de ser utilizados como herramienta biotecnológica. Además, se ha descripto una potente respuesta inmune innata inducida por BV en mamíferos que protege frente a una infección del virus influenza o frente al virus de la fiebre aftosa. La inyección de BV en ratones dispara la producción de IFN, activa macrófagos, células dendríticas y células NK. Se ha descripto en la inmunidad inducida por BV la importancia del TLR-9, una vez activo lleva a la producción de IFN-I. Sin embargo se ha visto que ratones TLR-9-/-producen IFN α en elevadas cantidades. También se demostró que fibroblastos de embrión murino (MEF) producen IFN β a partir de la infección con BV de un modo TLR independiente. Se ha sugerido entonces la participación de sensores de ADN citoplasmático involucrados en la producción de IFN-I por BV. STING es una proteína que induce la producción de IFN-I en respuesta a diversos estímulos, como la unión de ADNdc en el citosol con el receptor cGAS, mientras que RIG-I es un sensor de ARNdc, que producen IFN-I. Ambos fueron descriptos como partícipes de la producción de IFN β en respuesta a ADN o ARN. Adicionalmente, RIG-I podría funcionar como un sensor indirecto de ADN, pues secuencias ricas en AT pueden ser transcriptas en el citoplasma por la Pol III generando agonistas de RIG-I. Previamente, en nuestro grupo de trabajo hemos demostrado a través de ensayo de transducción con genes reporteros que por cada genoma baculoviral que alcanzan el núcleo hay 200 que quedan en citoplasma. Además, dichos resultados fueron validados a partir de un ensayo de FISH. Adicionalmente, hemos caracterizado el estado antiviral y cuantificado los niveles IFN β a las 4 horas post infección (h.p.i) en las células no inmunes de mamífero NIH 3T3 y MEF. Así, el objetivo es determinar qué receptores celulares citoplasmáticos están involucrados en el reconocimiento del ADN baculoviral en células no inmunes de mamífero. Para ello, en primer lugar se cuantificaron los niveles de IFN β por RT-qPCR y se realizaron ensayos antivirales a las 4 h.p.i en células NIH 3T3 que fueron previamente tratadas con un inhibidor químico de la RNA pol III. Los resultados muestran que tanto los niveles de IFN β como el estado antiviral generado por los baculovirus no se encuentran modificados. Adicionalmente, se evaluó la vía de sensadode ADN citoplasmático cGAS-STING en las células HEK293 y HEK293T. Las células HEK293 no presentan niveles detectables de cGAS, mientras que las células HEK293T no presentan niveles detectables ni de cGAS ni de STING. Cuando se cuantificaron los niveles de IFN β se obtuvo que en estas células no hay producción de ello. Sin embargo, las células HEK293 generan un estado antiviral luego de una infección de 4 h con BV. Además, estos resultados fueron apoyados por ensayos de transfección/transducción, en donde células HEK293 que fueron infectadas durante 4 h con BV disminuyeron significativamente la expresión de un gen reportero aportado por un plásmido. Por otra parte, a través de la herramienta de edición génica de CRISPR/Cas9 se obtuvo la línea NIH/3T3 STING -/- . En esta línea al cuantificar los niveles de IFN β por RT-qPCR luego de una infección con BV de 4 h se obtuvieron niveles significativamente disminuidos (p