Desarrollo de una línea celular de insecto para pseudotipar baculovirus con la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular y mejorar su eficiencia de transducción en mamíferos

PLASTINE MARÍA DEL PILAR; AMALFI SABRINA; LOPEZ MARÍA GABRIELA; TABOGA, OSCAR; ALFONSO VICTORIA

Encuentro; XLIII REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGÍA; 2023

Sociedad Argentina de Virología

Los baculovirus son virus que infectan insectos y son considerados como vectores virales promisorios para el transporte de genes en mamíferos, en los que no replican ni expresan significativamente sus propios genes; sin embargo, muestran distintos niveles de transducción según la línea celular utilizada. El pseudotipado de vectores virales es una estrategia ampliamente utilizada para mejorar el tropismo celular y aumentar la eficiencia de transducción. En este trabajo, nuestro objetivo fue desarrollar una línea celular estable de insecto derivada de Sf9 que, al infectarse con baculovirus, exprese la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) para lograr su incorporación pasiva en la envoltura de los viriones brotados. Inicialmente, el gen de VSV-G se clonó en un plásmido bajo el control de pXXL, un promotor fuerte e inducible por infección, muy tardío, construido previamente en nuestro laboratorio. La línea celular estable Sf9-VSV-G se obtuvo mediante selección por resistencia a blasticidina y posteriormente se diluyó a punto final para establecer líneas celulares oligoclonales. Debido a que VSV-G es una proteína fusogénica, se seleccionaron clones específicos en función del tamaño y el número de sincicios observados después de la infección con baculovirus. Luego, se evaluó el nivel de expresión de VSV-G por inmunodetección en extractos celulares infectados y, para la selección final de un único clon celular, se evaluó la incorporación de VSV-G en partículas virales purificadas. A continuación, se determinaron las condiciones de infección para el mejor rendimiento de pseudotipado mediante la línea celular. Para ello, se replicó un baculovirus capaz de expresar eGFP en mamíferos en la línea Sf9-VSV-G, utilizando cuatro diferentes multiplicidades de infección (MOI): 0,05; 0,25; 0,5 y 2,5; y cosechando el sobrenadante a los 3, 4 o 6 días postinfección (tres tiempos de cosecha). L, y luego se midió observó la expresión del gen reportero mediante con microscopía de fluorescencia y se cuantificó mediante citometría de flujo en células de mamífero. No se obtuvieron diferencias significativas al utilizar baculovirus obtenidos con distintas MOI. Por el contrario, el tiempo de cosecha resultó ser un factor fundamental en la obtención de vectores baculovirales pseudotipados, ya que se observó un aumento significativo en el número de células que expresan eGFP al utilizar baculovirus cosechados a los cuatro días postinfección. Finalmente, se pseudotiparon diferentes baculovirus que expresaban eGFP bajo el control de promotores activos en mamífero y se cuantificó la expresión del gen reportero en células de diversos orígenes derivadas de humano, ratón, hámster y mono. La eficiencia de transducción de los baculovirus pseudotipados aumentó consistentemente en todas las líneas celulares de mamífero ensayadas en comparación con los virus control. Estos resultados demuestran la factibilidad y las ventajas de mejorar el rendimiento en el transporte de genes vehiculizados por baculovirus sin la necesidad de incorporar el gen de pseudotipado en los genomas virales.