Clonado y expresión de la enzima alfa-galactosidasa de Lactobacillus fermentum CRL722

LEBLANC, J.G.; CARRERA SILVA, A.E:; SESMA, F.; SAVOY DE GIORI, G.

La Plata, Argentina

Congreso; Segundo Congreso Argentino de Microbiología General; 2005

Sociedad Argentina de Microbiología General

Estaquiosa y rafinosa, alfa-galactooligosacáridos (alfa-GOS) presentes en productos de soja, frecuentemente resisten la digestión y la absorción en el intestino delgado ya que los animales monogástricos (incluyendo los humanos) no poseen la enzima alfa-galactosidasa (alfa-Gal) gastrointestinal necesaria para hidrolizarlos. Como consecuencia, los alfa-GOS alcanzan el intestino grueso donde son fermentados por la microbiota intestinal liberando gases (CO 2 , H 2 y CH 4 ) los cuales pueden provocar efectos fisiológicos indeseables (hinchazón abdominal, flatulencias, y nauseas) en individuos sensibles. Microorganismos con actividad alfa-Gal constituyen una alternativa promisoria para eliminar los alfa-GOS presentes en soja, pero es difícil encontrar cepas que poseen dicha actividad y que sean inocuas para su empleo en alimentos. La importancia de la caracterización genética y bioquímica de alfa-Gal radica en la posibilidad de introducirla en bacterias lácticas, que colonizan el intestino delgado, para su uso como probiótico.El objetivo de este estudio fue clonar y expresar el gen melAque codifica para la enzima alfa-Gal de Lb.fermentum CRL722.Mediante PCR y utilizando cebadores degenerados, diseñados sobre la base de secuencias conservadas de genes de alfa-Gal  de otros microorganismos, se obtuvo un fragmento del genmelA. Diversas técnicas basadas en PCR (PCR inversa, Uneven PCR) permitieron conocer las regiones adyacentes al producto obtenido. Se logró elucidar la secuencia entera del gen a partir de la cual se diseñó cebadores específicos para poder amplificar el gen entero. El mismo fue clonado en el vector de expresión pET28b e introducido en E. coli BL21. La proteína recombinante fue purificada y caracterizada bioquímicamente comparándola a la proteína nativa producida por Lb. fermentum CRL722.Ambas proteínas fueron activas en un amplio rango de pH y temperaturas, características interesantes desde el punto de vista industrial ya que la actividad se mantiene a temperaturas superiores a 50ºC.El gen clonado debería ser expresado en otros microorganismos los cuales mediante fermentaciones usando sustrato de soja sean capaces de degradar los alfa-GOS. Asimismo, el desarrollo de un microorganismo probiótico con capacidad de degradar los alfa-GOS in situ resulta una propuesta atractiva de aplicación biotecnológica.