La Proteína NS5 del Virus Del Dengue 2 Altera El Splicing Celular Durante La Infección

DE MAIO, FEDERICO ANDRÉS; RISSO, GUILLERMO; IGLESIAS, NÉSTOR GABRIEL; SHAH, PRIYA; KROGAN, NEVAN; ANDINO, RAÚL; SREBROW, ANABELLA; GAMARNIK, ANDREA V.

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología; 2015

Sociedad Argentina de Virología (SAV)

El virus del dengue posee un genoma de ARN simple cadena depolaridad positiva el cual codifica un único marco abierto de lectura. ElARN viral es traducido en una poliproteína precursora de 10 proteínasvirales. La proteína NS5 es la de mayor tamaño (105 kDa), con undominio metiltransferasa y otro ARN polimerasa dependiente de ARN,siendo fundamental para la replicación viral. Con el objetivo deidentificar proteínas celulares que interaccionan con NS5 durante lainfección, se abordó un proyecto de proteómica. Para esto sedesarrolló un virus recombinante que expresa NS5 fusionada a unpéptido de purificación Strep-tag. Esto permite la recuperación de laproteína viral formando parte de complejos proteicos nativos en elcontexto de una infección. Utilizando como herramienta este virusmodificado, se infectaron líneas celulares humanas y se procedió luegoa analizar por espectrometría de masa las proteínas recuperadas. Seidentificaron así más de 50 proteínas celulares con interacciónespecífica a NS5 durante la infección. Entre estas se observó lapresencia de componentes del spliceosoma, destacándose entre ellosvarios factores que integran la ribonucleoproteína denominadacomplejo U5. Estos hallazgos fueron validados por estudios deinteracción de NS5 sobre-expresada con componentes específicos delspliceosoma por medio de co-precipitaciones.Con el fin de indagar sobre un posible efecto de la infección viral sobreel splicing celular, analizamos en células no infectadas e infectadas unaserie de eventos de splicing alternativo de distintos genes por unaestrategia de PCR que permite detectar las distintas formas resultantesde este proceso (inclusión o exclusión de un determinado exón en elARN mensajero maduro). Mediante esta técnica determinamos que lainfección viral tiene un claro efecto sobre la abundancia relativa de lasisoformas analizadas. En vista de estos hallazgos, estudiamos el efectodirecto de la proteína NS5 sobre eventos de splicing por medio de lasobre-expresión de la proteína fuera del contexto de la infección. Paraello transfectamos un vector de expresión de NS5 conjuntamente conplásmidos portando ?minigenes?, construcciones utilizadas comoreporteras de splicing. Los resultados de estos ensayos mostraron unimportante efecto de NS5 alterando la relación de isoformas en elsistema usado. Por último, para estudiar la relevancia que la interacciónNS5-spliceosoma pudiera tener para la replicación viral, decidimosrealizar ensayos de RNA de interferencia para componentes delspliceosoma identificados como interactores de NS5.Interesantemente, se observó que al interferir ciertos factores delcomplejo U5 se produjo un incremento significativo en la replicaciónviral.Los resultados obtenidos indican que el virus del dengue altera elpatrón de splicing en células humanas infectadas, por un mecanismoque involucra a la proteína NS5 y que probablemente esto de lugar a unestado celular más favorable para la replicación viral.