Chlamydia trachomatis PCR-based diagnostic

CRIBB PAMELA; SCAPINI JUAN PABLO; SERRA ESTEBAN

Buenos Aires, Argentina

Workshop; III International Workshop of Chlamydia, Brucella and Micobacterium infections in humans and animals.; 2000

Asociación Argemntina de Zoonosis; Fac Cs Veterinarias, UBA; Fac Farmacia y Bioquímica, UBA

Diagnóstico de Chlamydia trachomatis por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Pamela Cribb*§; Juan Pablo Scapini§ y Esteban Serra* *Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR). Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario. Suipacha 531. §Instituto de Investigaciones Microbiológicas y Clínicas. Entre Ríos 340, Rosario. idimyc@idimyc.net Si bien en la actualidad existen numerosos métodos para la detección de Chlamydia tachomatis, la mayoría presenta grandes limitaciones, por lo que el diagnóstico de este patógeno intracelular continúa siendo un desafío para los laboratorios clínicos.  En la última década se han desarrollado métodos de diagnóstico basados en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Esta técnica presenta numerosas ventajas, principalmente su elevada sensibilidad y especificidad. Con el fin de evaluar y comparar la sensibilidad de dos métodos de diagnóstico de C.trachomatis por PCR, se construyeron plásmidos conteniendo los fragmentos de ADN producidos por amplificación de secuencias específicas de dicha especie. Se realizaron reacciones de PCR sobre diluciones de dichos plásmidos observándose límites de detección de 103 y 102  copias de ADN molde, respectivamente. Uno de los mayores problemas del diagnóstico por PCR es la aparición de falsos negativos debidos a inhibidores de la polimerasa presentes en las muestras clínicas. Para poder validar los resultados negativos, se contruyeron controles internos para las reacciones de PCR. Éstos son plásmidos que contienen secuencias de ADN complementarias a los oligonucleótidos específicos del ensayo, pero generan un producto de amplificación de tamaño diferente al esperado para una muesta positiva, y pueden distinguirse facilmente mediante electroforesis en gel de agarosa. El uso de controles internos permite descartar la posibilidad de que un resultado negativo se deba a una inhibición de la PCR. Las sensibilidades observadas para los dos métodos evaluados, resultaron relativamente bajas para ser aplicadas al diagnóstico de rutina. Para aumentar la sensibilidad, se diseñó una PCR anidada (“Nested” PCR). Esta técnica fue ensayada sobre plásmidos control, dosados por métodos espectrofotométricos, y sobre ADN proveniente de cultivos titulados de C. trachomatis, demostrando ser capaz de detectar una cantidad de ADN equivalente a una bacteria. Por último se evaluaron 200 muestras provenientes de pacientes por los métodos de PCR simple y anidada. Los resultados obtenidos demuestran que la técnica de “Nested” PCR permite detectar muestras positivas con bajo título, incapaces de generar un producto de amplificación detectable con una reacción simple.