Obtención de líneas celulares de Trypanosoma cruzi editadas genéticamente mediante CRISPR/Cas9 para el estudio de la proteína High Mobility Group B de Trypanosoma cruzi

VARGAS TRINIDAD, ANDREA SUSANA; SENSOLINI, LOANNA; CRIBB, PAMELA

Mendoza

Congreso; XI Congreso de la Sociedad Argentina de Protozoología; 2022

Sociedad Argentina de Protozoología

Trypanosoma cruzi es el protozoo parásito causante de la Enfermedad de Chagas, endémica en América Latina, y considerada una de las enfermedades desatendidas. Las proteínas High Mobility Group B (HMGB) son proteínas no histonas de la cromatina que se unen al ADN afectando su grado de compactación y así participan en la regulación de la expresión de genes y de otros procesos como la recombinación, la replicación y la reparación del ADN. Para estudiar la proteína HMGB de Trypanosoma cruzi (TcHMGB), se planteó como objetivo editar el genoma de T. cruzi e intentar obtener cepas mutantes knock out (KO) para TcHMGB y la proteína expresada con una etiqueta (?tagged?) de hemaglutinina (HA) mediante el sistema CRISPR/Cas9. Para esto se construyeron plásmidos para expresar la nucleasa Cas9 y un ARN guía que dirige la enzima al sitio de corte deseado (pTREX-Cas9/sgRNA-TcHMGB) y se diseñaron y obtuvieron por PCR fragmentos de ?ADN donor? para favorecer la reparación del ADN mediante recombinación homóloga introduciendo secuencias de resistencia para la selección de los transfectantes. Se cotransfectaron epimastigotes de T. cruzi Dm28c con el plásmido pTREX-Cas9/sgRNA-TcHMGB y ADN donor correspondiente para cada estrategia de edición (KO y tagged) y luego de 5 semanas, se seleccionaron parásitos resistentes a los antibióticos utilizados en cada caso. Se confirmó la ausencia del gen, en el caso del KO, y la presencia de la etiqueta de HA en el tagged por PCR, y se evaluó la expresión génica de tchmgb por qRT-PCR y la producción de la proteína TcHMGB por western blot. Finalmente, se evaluó el crecimiento de las cepas editadas comparando con cepas WT. La cepa KO, mostró una menor expresión de hmgb y un crecimiento enlentecido en comparación a la cepa WT. Estos resultados, junto a los obtenidos previamente confirman la importancia del control fino de los niveles de TcHMGB para la biología del parásito y permitirán continuar con el estudio del rol de la proteína TcHMGB.