El doble mutante puntual del Bromodominio 3 de Trypanosoma cruzi (TcBDF3) se comporta como un mutante dominante negativo

ALONSO, VICTORIA LUCÍA; CRIBB, PAMELA; SERRA ESTEBAN

Rosario

Congreso; XXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Portozoología; 2013

Sociedad Argentina de Protozoología

El factor Bromodominio 3 de Trypanosoma cruzi (TcBDF3) es una proteína de 224 aminoácidos con un bromodominio en su extremo N-terminal. Este dominio tiene la capacidad de unir lisinas acetiladas y representa un módulo evolutivamente conservado presente casi exclusivamente en proteínas de localización nuclear. El extremo C-terminal no tiene homología con otros dominios conocidos pero podría estar interaccionando con otras proteínas. En trabajos previos, mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica determinamos que TcBDF3 en amastigotes y epimastigotes se localiza en todo el cuerpo celular del parásito observándose más intensamente marcada la región del bolsillo flagelar y el flagelo. En tripomastigotes la localización cambia totalmente y observamos a TcBDF3 solo en el flagelo. Además, demostramos que esta proteína interacciona con tubulina α acetilada presente en el citoesqueleto y flagelo de T. cruzi. En este trabajo se diseñaron mutantes puntuales para TcBDF3 en aminoácidos que fueron predichos como importantes para la unión del ligando acetilado. Luego se transfectaron epimastigotes de la cepa Dm28c pLew13 con las secuencias mutantes insertadas en el vector inducible por tetraciclina pTcINDEX-GW. A todas las secuencias mutantes se les agregó un epítope de HA. Una vez completado el proceso de selección se corroboró la sobre-expresión de los mutantes mediante western blot e inmunofluorescencia con anticuerpos anti-HA. Luego se realizaron curvas de crecimiento, donde observamos una disminución del crecimiento en la cepa que sobre-expresa la proteína doble mutante. Por otro lado, los ensayos de metaciclogénesis in vitro mostraronuna disminución en el número de trypomastigostes metacíclicos en las cepas que expresaban TcBDF3 con una o dos mutaciones puntuales. Estos resultados nos permite hipotetizar sobre un posible rol de TcBDF3 en la diferenciación de Trypanosoma cruzi en el cual ocurre un extenso remodelado del citoesqueleto.