Efectos del estradiol a través del Receptor estrogénico beta sobre la proliferación celular adenohipofisaria.

IGNACIO WAGNER; PABLO A. PÉREZ; SILVINA GUTIERREZ; ALICIA I. TORRES

Bariloche

Congreso; 4to Congreso Argentino de Microscopía - SAMIC; 2016

Comité Interamericano de Sociedades de Microscopia (CIASEM)

Los niveles de 17β-estradiol (E2) fluctúan en el ciclo estral, preñez y lactancia modulando la población celular adenohipofisaria para adecuarla a los requerimientos hormonales del organismo. Estos efectos son mediados por sus receptores estrogénicos específicos (RE) α y β, ambos presentes en adenohipófisis. En nuestro laboratorio se estudia desde hace varios años los efectos del E2 a través del REα, el cual sería el principal responsable de las acciones de los estrógenos, conociéndose muy poco sobre los efectos del REβ en la adenohipófisis. Este subtipo está presente en la glándula ya que se ha detectado el ARNm y la proteína en el 20% de las células endocrinas adenohipofisarias. Se ha sugerido que participaría en la regulación de la secreción de prolactina y se ha observado que en ratones hembra la pérdida del REβ indujo el desarrollo de grandes tumores hipofisarios. Estos antecedentes inducen a investigar la expresión del REβ en situaciones fisiológicas y patológicas adenohipofisarias y analizar su implicancia funcional en esta glándula. Para llevar a cabo este objetivo se utilizaron ratas hembra Wistar en diferentes etapas del ciclo estral, células GH3 transfectadas para la sobre-expresión del REβ (GH3β+) y un modelo de hipófisis hiperplásicas/adenomatosas inducido por la implantación de cápsulas de benzoato de estradiol por 20, 40 y 60 días. Se realizaron cultivos celulares estimulados con E2 y con agonistas específicos de ambos subtipos de RE (PPT: agonista del REα y DPN: agonista del REβ).Se determinó la expresión del REβ, REα, PTEN, ciclina D1 y p21 por microscopía electrónica, western blot, inmunofluorescencia y citometría de flujo. Se cuantificó la proliferación celular (BrdU) y el contenido de ADN (Ioduro de propidio). Análisis estadístico: test Anova-Tukey y Dunnet. En primer lugar se determinó la expresión y localización subcelular del REβ durante el ciclo estral y en el desarrollo tumoral adenohipofisario. Se observó que en proestro el 35.4 ± 2.5% de las células adenohipofisarias fueron REβ+, en estro un 18.79 ± 1.1 %, mientras que en diestro un 34.12 ± 7.7 % de células expresaron el REβ, indicando que la expresión del REβ fluctúa durante el ciclo estral, con un descenso en estro. En el modelo hiperplásico/adenomatoso se detectó una disminución gradual de su expresión, junto a una caída significativa del supresor tumoral PTEN. Estos resultados fueron confirmados con western blot y cuantificados por citometría de flujo Por microscopía electrónica se analizó la distribución subcelular del REβ, observando partículas de oro coloidal en citosol libre, retículo endoplasmático rugoso, mitocondrias y en el núcleo. En segundo lugar se analizaron los efectos de la sobre-expresión del REβ en la línea tumoral GH3 (GH3β+), con una inhibición significativa de la proliferación y del número de células en fase proliferativa, en comparación con GH3 transfectadas con el plásmido vacío (GH3β-). Esto fue acompañado de una disminución de la expresión de ciclina D1 y del REα, tanto en GH3β+ control como en las estimuladas con el agonista específico del REβ (DPN). Además, se observó que la estimulación con DPN modificó la localización subcelular de p21, incrementando su expresión nuclear, sugiriendo que la estimulación del REβ induce translocación de p21 al núcleo donde bloquea la progresión de la fase S del ciclo celular. Finalmente mediante microscopía electrónica utilizando una doble inmunomarcación con oro coloidal de 5 y 15 nm se identificaron ambas proteínas, REβ y p21, solas o asociadas, a una distancia menor de 5 nm. Estos resultados fueron validados mediante ensayos de inmunoprecipitación. Estos resultados sugieren que el E2 podría modular la expresión del REβ, inhibiendo su expresión, debido a que el REβ fluctúa durante el ciclo estral, con un descenso en estro, cuando los niveles de E2 in vivo son altos y que la expresión del subtipo β cae significativamente durante el desarrollo tumoral inducido por la estimulación estrogénica crónica. Además, los resultados evidencian que el REβ podría ejercer un rol inhibitorio sobre la proliferación celular adenohipofisaria, con participación de ciclina D1 y p21 y mediante la inhibición de la expresión del REα