Estudio del mecanismo de reacción de la metalo-beta-lactamasa GOB

MARÍA-NATALIA LISA; LARS HEMMINGSEN; ALEJANDRO J. VILA

Santa Fe

Workshop; Cuarto Workshop de Química Bioinorgánica: Aspectos estructurales y funcionales de sistemas bioinorgánicos estudiados mediante métodos espectroscópicos, de cálculo, y sistemas modelo; 2010

Cuarto Workshop de Química Bioinorgánica

Las metalo-beta-lactamasas (MBLs) son enzimas bacterianas que usan Zn(II) como cofactor esencial para la hidrólisis de antibióticos beta-lactámicos. Se ha aceptado que las MBLs con un amplio espectro de sustratos alcanzan su máxima eficiencia catalítica al unir dos iones Zn(II) en los sitios Zn1 y Zn2 delsitio activo, en tanto que por otro lado existe un pequeño y excepcional grupo de carbapenemasas restrictas que actúan con un único ión metálico en el sitio Zn2. Actualmente no se conocen plenamente los roles y la esencialidad de cada sitio metálico en la hidrólisis mediada por MBLs, siendo ésta la principal causa de la carencia de inhibidores de su actividad. Resulta evidente entoncesla necesidad de ampliar la comprensión de las bases moleculares del mecanismo catalítico de las MBLs. La única excepción conocida en el paradigma de las MBLs es GOB de Elizabethkingia meningoseptica. Previamente hemos demostrado que ésta es una enzima de amplio espectro de sustratos y que alcanza máxima actividad uniendo únicamente el ión Zn2. Así, GOB constituye un modelo excepcional para la inspección del rol de esteión metálico en una lactamasa de amplio espectro. En este trabajo se describe el estudio del mecanismo de reacción empleado por GOB para la hidrólisis de nitrocefina. Diversos grupos han informado la acumulación de un intermediario aniónico en la hidrólisis de esta cefalosporina sintética mediada por enzimas dinucleares. En dicho intermediario el enlace C-N se encuentra escindido en tanto que el N de la amina saliente se halla cargado negativamente y desprotonado. Empleando técnicas de cinética rápida se observó la acumulación de un intermediario de reacción en la hidrólisis de nitrocefina catalizada por GOB, idéntico a lo descrito para enzimas dinucleares. Estos hallazgos sugieren que el ión Zn2 es esencial para la estabilización del intermediario en todos los casos. Esta idea se exploró empleando la estrategia de sustitución metálica para generar derivados de GOB que luego fueron estudiados a fin de evaluar los cambios inducidos en el mecanismo de reacción. Sustentando la hipótesis inicial, se observó que la hidrólisis de nitrocefina catalizada por Co(II), Ni(II) y Cd(II)-GOB cursa con conversión directa de sustrato a producto. Asimismo, la unión de los metales al sitio Zn2 se confirmó en todos los casos mediante el análisis por diversas técnicas espectroscópicas s, la uni los cualeso aproductoor diendo comopreviamente para Zn(II)-GOBmbios inducidos en el mecanismo de reaccide los derivados de la enzima silvestre y de una mutante puntual. En resumen, la evidencia obtenida indica que el sitio de unión a metal en GOB se encuentra involucrado en la estabilización de un intermediario aniónico de reacción que se acumula durante la catálisis, favoreciendo la ruptura del enlace C-N luego del ataque nucleofílico. Ésta podría tratarse de una estrategia conservada susceptible de ser usada como blanco para el diseño racional de inhibidores dela actividad MBL.