BIOPROSPECCIÓN DE ENZIMAS EN UNA BIBLIOTECA METAGENÓMICA CONSTRUIDA A PARTIR DE SEDIMENTOS COSTEROS DE BAHÍA USHUAIA

GONZALEZ J.; MUSUMECI M. A.; LOZADA M.; DIONISI H. M.

Bahia Blanca

Congreso; XI SIMPOSIO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA; 2017

REDBIO - Red de Laboratorios de biotecnología para América Latina y el Caribe

Las comunidades microbianas que habitan ambientes marinos extremos resultan de particular interés para la bioprospección de enzimas. Un ejemplo de este tipo de ambientes son los sedimentos de la zona intermareal de la Planta de Combustibles Orión, en Bahía Ushuaia, Tierra del Fuego. Estos sedimentos están expuestos a cambios bruscos de temperatura, humedad y salinidad, alta radiación UV-B, bajas temperaturas gran parte del año y contaminación crónica por hidrocarburos. Dada a la imposibilidad de cultivar la mayoría de los microorganismos marinos, en el Laboratorio de Microbiología Ambiental hemos clonado grandes fragmentos de los genomas de estos microorganismos en vectores apropiados. Esta biblioteca metagenómica contiene aproximadamente 46.000 clones con fósmidos llevando insertos de 35-45 Kb cada uno. A fin de facilitar la prospección de los genes de interés, la biblioteca fue totalmente secuenciada utilizando la plataforma Illumina HiSeq 1500. El ensamblado de las lecturas (N50 = 24 - 30 Kb) generó un set de datos conformado por 105 scaffolds y 7 x 105 secuencias codificantes, la mayoría de ellas completas. Estos genes se encuentran fácilmente accesibles dado que pueden ser amplificados a partir de los fósmidos de la biblioteca.El análisis bioinformático de la biblioteca mostró que la misma contiene fragmentos genómicos de organismos procariotas pertenecientes a 28 phyla, siendo los más abundantes Proteobacteria, Actinobacteria y Planctomycetes. La anotación de las secuencias codificantes utilizando la herramienta BlastKOALA indicó la presencia de 1.4 x 105 secuencias correspondientes a enzimas, de casi 2.000 códigos EC diferentes. En el caso de las peptidasas, se identificaron más de 8.000 secuencias pertenecientes a 79 familias (MEROPS) y 7 mecanismos diferentes de catálisis. Utilizando dominios pfam, se identificaron además 342 secuencias correspondientes a la subunidad mayor de hidroxilasas de compuestos aromáticos. Por otra parte, en cuanto a las CAZymas, se identificaron 248 secuencias de alginato liasas putativas y 7 secuencias de fucoidanasas utilizando la herramienta dbCAN. En base a análisis de su contexto genómico, estructura primaria y/o modelado de la estructura tridimensional, se seleccionaros secuencias con rasgos de potencial interés para su expresión heteróloga. Tres hidroxilasas de hidrocarburos aromáticos fueron clonadas y expresadas en Escherichia coli, como así también sus respectivas proteínas transportadoras de electrones. Estas enzimas catalizan la adición estereo-específica de dos oxhidrilos en anillos aromáticos y resultan interesantes para la industria química dado que producen en una simple etapa compuestos con una quiralidad específica (llamados cis-dihidrodioles) que son utilizados como intermediarios en la síntesis de distintos fármacos. Respecto a las CAZymas, dos alginato liasas fueron clonadas y expresadas en Escherichia coli. Además, estas enzimas fueron purificadas y mostraron capacidad de degradar alginato mediante ensayos de actividad enzimática. Por último, dos fucoidanasas fueron clonadas y expresadas en Escherichia coli.