Determinación de tripsina inmunoreactiva empleando un inmunosensor microfluídico modificado con nanopartículas de sílica aplicado la detección de fibrosis quística

MARCOS A. SEIA; PATRICIA W. STEGE; CARLOS A. FONTAN; IRMA E. DE VITO; JULIO RABA; GERMÁN A. MESSINA

Mar del plata

Congreso; XXIX Congreso Argentino de Química; 2012

Durante el año 2007 el Senado sancionó la ley de pesquisa neonatal, que obliga ala detección gratuita en el recién nacido de una serie de enfermedades graves,como también su tratamiento. Se trata de enfermedades que carecen demanifestaciones clínicas durante los primeros días o meses de vida. No obstante,estas enfermedades, que pueden llegar a producir daño severo e irreversible comoretraso mental, neurológico o psicomotor e incluso la muerte. La eficacia en eltratamiento depende de la implementación precoz del mismo.Dentro de las mismas, la Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad que secaracteriza por presentar alteraciones en los pulmones y el páncreas. La causa dedicha patología es una mutación genética en el gen que codifica el Regulador deltransporte transmembrana en Fibrosis Quística (CFTR), la cual trae comoconsecuencia la perturbación en el transporte de iones cloruro. La falla de laproteína CFTR causa discapacidad progresiva y muerte prematura mientras que sutratamiento precoz mejora la calidad y las expectativas de vida. El análisis de éstasenfermedades se realiza empleando gotas de sangre tomadas del talón del bebéentre el nacimiento y el séptimo día de vida.Por la relevancia que la detección precoz de esta patología posee es necesario edesarrollo de tecnologías alternativas, rápidas y sensibles. En este trabajo sedesarrolló un inmunosensor microfluídico, modificado con nanopartículas de sílica,acoplado a un sistema de detección de Fluorescencia Inducida por Láser (LIF)mediante fibras ópticas la cuantificación rápida y sensible de anticuerpos antitripsinainmunoreactiva (IRT) en muestras de sangre humana.MetodologíaEl Dispositivo utilizado para la determinación de Tripsina Inmuno Reactiva (IRT)consiste en un chip de vidrio con un canal central (CC), el cual ha sido modificadocon partículas de sílica para la posterior inmovilización de anticuerposmonoclonales Anti-IRT (Figura 1). La tripsina presente en las muestras de sueroreacciona inmunológicamente con el anticuerpo Anti-IRT inmovilizado y luego lamisma es reconocida mediante el empleo de un anticuerpo secundario específicomarcado con la enzima peroxidasa (HRP). HPR, en presencia de peróxido dehidrogeno (H2O2) cataliza la oxidación de 10-acetil-3,7-dihidroxifenenoxazina aresorufina, la cual fue determinada mediante LIF utilizando una laser de excitaciónde 561 nm y midiendo la emisión fluorescente a 585 nm. La Fluorescencia relativagenerada por el producto de reacción es proporcional a la actividad de la enzima, yconsecuentemente, a la cantidad de IRT presente en la muestra de suero.2Fig 1 Representacion esquematica de la modificación y la reacción inmunológica eninmunosensor microfluídicoResultadosDiferentes parámetros fueron estudiados para el óptimo desempeño delinmunosensor microfluídico propuesto.Se llevó a cabo un análisis de la velocidad de flujo óptima, para lo cual se evaluaronlas respuestas obtenidas para un estándar de 154 ng mL-1 a diferentes velocidadesde flujo en un rango de1-6 μL min−1 , la velocidad óptima resultante fue de 2 μLmin−1 .Del modo similar se evaluó el volumen de muestra òptimo a inyectar, usando unestándar de 154 ng mL-1, en un rango de 1?30 μL min−1. La respuesta seincrementó linealmente y la sensibilidad se cuadruplicó para el caso de volúmenesde muestra entre 1-20 μL min−1. Consecuentemente el volumen de muestraempleado fue de 20 μL min−1.L.Para el método propuesto se obtuvo una curva de calibración para la detección deIRT en muestras de suero, en un rango de 0-580 ng mL-1. La ecuación de regresiónlineal fue RF = 1.964 + 0.339 *CIRT, con un coeficiente de regresión lineal r=0.998.El coeficiente de variación (CV) para la determinación de 154 ng mL-1de IRT fuemenor del 5 % (n=6). El límite de detección (DL) fue 0.87 ng mL-1.El inmunosensor fluorescente fue comparado con un sistema espectrofotométricocomercial para la cuantificación de IRT en 10 muestras de suero humano. Lapendiente obtenida fue cercana a 1, indicando una buena correspondencia entre losdos métodos. Comparado con el ELISA, el método propuesto mostró un granincremento de sensibilidad.3ConclusionesEn este trabajo, se desarrolló un inmunosensor microfluídico acoplado a detecciónLIF, para cuantificar IRT en forma rápida y selectiva en suero de pacientes conFibrosos Quística.Las partículas de sílica, además de ser utilizadas como soporte de inmovilización,produjeron un incremento en la superficie y consecuentemente en la sensibilidaddel sistema propuesto. Otros beneficios aportados por el sensor fueron: reducidostiempos de análisis (35 min), menor consumo de muestra y reactivos respecto alinmunoensayo convencional. Por lo antes mencionado este inmunosensormicrofluídico representa una herramienta extremadamente útil para brindar undiagnóstico rápido, sensible y automatizado de la Fibrosis Quística.Referencias[1] de Valk HW, van der Graaf EA. Cystic fibrosis-related diabetes in adults: wherecan we go from here? Rev Diabet Stud 2007;4(1):6?12.[2] Houwen RH, van der Doef HP, Sermet I, et al. on behalf of the ESPGHAN CysticFibrosis Working Group. Defining DIOS and constipation in cystic fibrosis with amulticentre study on the incidence, characteristics, and treatment of DIOS. J PediatrGastroenterol Nutr 2010;50:38?42.[3] Colombo C, Battezzati PM, Crosignani A, et al. Liver disease in Cystic Fibrosis: aprospective study on incidence, risk factors and outcome. Hepatology2002;36:1374?82.[4] European cystic fibrosis bone mineralisation guidelines.[5]Cystic Fibrosis Foundation. About cystic fibrosis: what you need to know.Bethesda, MD; [updated 2010 January 27; cited 2011]. Available from:http://www.cff.org/AboutCF/.