Cromatografía de afinidad con iones de paladio inmovilizados para la recuperación de proteínas con etiquetas de histidina

PAMELA KIKOT; MARCELO FERNANDEZ LAHORE; MARIANO GRASSELLI

Rosario

Congreso; VII Congreso Argentino de Ingeniería Química; 2013

Asociación Argentina de Ingenieros Químicos

En el estado actual de la tecnología de bioprocesos se observa un gran avance en los procesos fermentativos con el desarrollo y empleo de diferentes aproximaciones a la expresión de proteínas heterólogas. Sin embargo, la recuperación y purificación de productos (conocida en inglés como Downstream processing o DSP) todavía tiene un número importante de problemas a ser resueltos, como los altos costos. La mayoría de los procesos de DSP de bioproductos están basados en separaciones cromatográficas. La cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC) se amplió de manera significativa por la utilización del ácido iminodiacético (IDA) y tricarboxi etilenediamina (TED) como quelantes de iones para el aislamiento de proteínas (Porath, 1992). Varias aplicaciones de IMAC con iones metálicos han sido revisadas en detalle por diferentes autores (Gutiérrez et.al., 2007). De todos ellos el Ni(II) es el mejor compromiso en selectividad y afinidad en la purificación de proteínas recombinantes con etiquetas de His (agregadas en el extremo N o C terminal) con afinidad por iones metálicos; con un grado de purificación del orden de 80 al 90%. La combinación de la obtención de proteínas recombinantes en E. coli con etiquetas peptídicas de reconocimiento fue de gran utilidad en los laboratorios de investigación permitiendo la rápida purificación de la proteína con una matriz cromatográfica económica. En este trabajo se estudió la purificación de proteínas recombinantes con etiquetas de His mediante cromatografía de afinidad con iones de paladio inmovilizados. No se encontraron publicaciones preexistentes donde el Pd(II) fuese aplicado a la separación de proteínas (Jaya y García, 2001). La proteína utilizada como modelo fue la GFP (con etiqueta de 6 His, GFPhis6), debido a que es una proteína de fácil seguimiento (fluorescencia), permitiendo el estudio de una variedad de condiciones de una manera sencilla. Se observó que el ión Pd(II) se inmoviliza eficientemente en una resina comercial con IDA como grupo quelante. Además, fue posible determinar la adsorción de GFPhis6 en IDA-Pd. Como eluyentes fueron probados diferentes compuestos con grupos funcionales azufrados y nitrogenados capaces de complejar Pd-IDA y Ni-IDA, desalojando a la proteína sin desplazar los iones metálicos de la resina. La tiourea 0.1M fue el mejor eluyente ya que eluye eficientemente GFPhis6 del sistema Pd-IDA pero no eluye la proteína del sistema Ni-IDA; mientras que la solución de imidazol 50 mM, utilizado convencionalmente para la elución de Ni-IDA, desplaza el Pd(II) inmovilizado de la resina. Porath J. O., Protein Expr. and Purif. 3 (1992) 263-281 Gutiérrez R., Martín del Valle E. M., Galán M. A., Separation & Purification Reviews 36 (2007) 71-111 Jaya M., García A. A. Reactive & Functional Polymers 51 (2002) 15-24