CULTIVO DE ALTA DENSIDAD DE ESCHERICHIA COLI RECOMBINANTE A ESCALA DE 5 LITROS PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOMOLÉCULAS

DANIEL WILLE; MARIANO GRASSELLI; PAMELA KIKOT

Jornada; IV JORNADAS DE INVESTIGADORES EN FORMACIÓN CYT UNQ; 2021

UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES

El desarrollo de técnicas para la producción de cultivos de alta densidad celular (HCDC) facilita la producción de biomoléculas. Las ventajas del HCDC son la mejora de la productividad, un volumen de cultivo reducido facilitando su procesamiento, simplifica la separación celular, mejora el rendimiento en la recuperación del producto, reduce la cantidad de desechos, los costos de producción y la inversión en equipos1,2. La tecnología de producción biomoléculas utilizada actualmente se basa en microorganismos modificados genéticamente como E. coli. Esta es una de las células hospedadoras más utilizadas debido a su corto tiempo de división, su capacidad para usar sustratos económicos y su genética bien caracterizada y factible de modificar3.En este trabajo se optimizó el HCDC de diferentes cepas de E. coli: BL21(DE3), BL21(DE3) pLysS, M15, DH10B y JM109. Se estudiaron medios de cultivo minerales y complejos y distintas estrategias de producción (cultivos en lote y en lote con alimentación). En los ensayos se utilizó un biorreactor de 5 litros de volumen final (BIOSTAT Aplus, Sartorius) empleando medio LB, LB modificado (adición de glucosa) y el medio mineral Riesenberg4. Durante el proceso se registraron parámetros en línea (pH, gaseado, agitación, DO%, temperatura) y se midieron peso seco, densidad óptica a 600 nm (DO600) y concentración de glucosa. El DO% se mantuvo por encima de 10% mediante control automático de la agitación o bien mediante la mezcla de aire con oxígeno puro. El pH se fijó alrededor de 6,5 mediante el agregado de HCl o NH3. En la etapa de alimentación se empleó un caudal lineal de una solución 300 g/l de glucosa.Todas las cepas estudiadas manifestaron parámetros estequiométricos y cinéticos diferentes. Mientras que el desarrollo de E. coli JM109 fue óptimo en medio LB, fue menor en LB modificado y escaso en medio mineral. La cepa DH10B creció mejor en LB modificado (tiempo de duplicación (TD): 1 h, DO600 final: 13 uA) que en medio Riesenberg con agregado de Leucina (TD: 3 h, DO600 final: 9 uA). Mientras que la cepa M15 tuvo resultados satisfactorios en medio mineral Riesenberg, la cepa que se logró cultivar más eficientemente en dicho medio fue E. coli BL21 (DE3). Para la misma se optimizó un cultivo en lote con alimentación lineal que alcanzó 180 uA de DO600. La misma metodología de cultivo empleada en la cepa BL21(DE3) pLysS, mostró que esta posee requerimientos de oxígeno mayores y restricciones metabólicas más exigentes que BL21(DE3), por lo que no se logró superar las 60 uA, requiriendo la inclusión de un sistema de alimentación exponencial para mejorar el rendimiento.