Estudio del metabolismo microaeróbico de la especie Antártica Pseudomonas sp. 14-3: Análisis de los fenotipos regulados por Anr

TRIBELLI PAULA; MENDEZ BEATRIZ; LÓPEZ NANCY

Mar del Plata, Argentina

Congreso; XLIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica y Biología Molecular; 2007

Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología Molécular

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son polímeros de reserva bacterianos que se acumulan en condiciones de crecimiento desbalanceado. Estos polímeros funcionan como un reservorio de carbono y electrones, por lo que tienen un papel importante en el balance redox celular y también en la sobrevida y resistencia a estrés. Pseudomonas sp. 14-3 una cepa procedente de la Antártida y aislada en nuestro laboratorio, acumula gran cantidad de polihidroxibutirato (PHB), el PHA más estudiado, y presenta una alta supervivencia y resistencia a estrés. Es nuestro objetivo general analizar en esta especie la interacción de la expresión de los genes que intervienen en la síntesis de PHA con los genes involucrados en la redes regulatorias globales en bacterias, específicamente, en este trabajo, el regulador global del metabolismo anaerobico, anr. Anr controla la expresión de los genes que codifican las enzimas involucradas en el crecimiento anaeróbico, entre ellas,  las relacionadas con la utilización del nitrato como aceptor de electrones alternativo al oxigeno y la fermentación de la arginina que provee energía a través de fosforilación oxidativa a nivel de sustrato. En este trabajó se analizó el crecimiento de Pseudomonas sp. 14-3 en microaerofilia y anaerobiosis en medios suplementados con nitrato, detectándose la producción de nitritos derivados de la reducción del nitrato durante el crecimiento en condiciones de baja tensión de O2. La fermentación del aminoácido L-arginina permitió el crecimiento y el mantenimiento del cultivo bacteriano en condiciones microaeróbicas y se determinó la actividad de la enzima arginina deiminasa. Los experimentos se realizaron utilizando Pseudomonas aeruginosa como control, dado que el metabolismo del nitrato y las enzimas involucradas en la fermentación de la arginina han sido estudiados ampliamente en esta especie. El gen anr de Pseudomonas sp.14-3 fue obtenido mediante amplificación por PCR utilizando  primers diseñados a partir de secuencias conservadas de otras especies de Pseudomonas. El fragmento obtenido fue clonado y su funcionalidad fue evaluada mediante experimentos de complementación utilizando una mutante de Escherichia coli que posee una deleción en el gen fnr, homólogo a anr. Se analizaron distintos fenotipos regulados por fnr en E. coli como la producción de gas por fermentación de glucosa y la morfología y el color de las colonias en agar Mac Conkey suplementado con nitrato en anaerobiosis. En ambos casos el gen anr de Pseudomonas sp. 14-3 fue capaz de restaurar el fenotipo salvaje en la mutante de E. coli. La secuenciación del fragmento de Pseudomonas sp. 14-3 reveló la presencia del gen completo (738 pb) y mostró alta identidad (88%) con el gen anr de Pseudomonas fluorescens Pf-1. Teniendo en cuenta que el PHB juega un papel importante en el balance redox celular por ser un reservorio de poder reductor, es probable que Anr esté involucrado en la regulación del metabolismo del PHB. Una evidencia a favor de esto lo constituye el hallazgo de un probable Anr-box, sitio específico al cual se une el regulador Anr en condiciones de baja tensión de oxígeno para controlar la transcripción de los genes que regula. El clonado del gen anr de Pseudomonas sp. 14-3 constituye un primer paso que permitirá en el futuro, a través de la construcción de mutantes, la evaluación de la influencia de este regulador en la fisiología de esta bacteria, y en particular en la síntesis de PHB.