Caracterización funcional de una metionina sulfóxido reductasa hibrida de Trypanosoma cruzi Dm28c

GONZALEZ, LN; BIROCCO, F; GUERRERO, SA; IGLESIAS, AA; ROBELLO, C; ARIAS, DG

Buenos Aires

Simposio; XX Simposio Internacional sobre Enfermedades Desatendidas; 2021

Fundación Mundo Sano

La metionina es un aminoácido susceptible a oxidarse a metionina sulfóxido(MetSO). La reducción de MetSO a metionina está catalizada por la enzimametionina sulfóxido reductasa (MSR). Hace unos años se descubrió un tipo deMSR, la free MSR (fMSR), que cataliza la reducción de Met(R)SOlibre (no proteico) en forma específica. Trypanosoma cruzi es el agenteetiológico de la enfermedad de Chagas y es auxótrofo en metionina. A través deun análisis de su genoma, identificamos una secuencia codificante para la fMSR,la cual está constituida por un dominio de tipo GAF fusionado a un dominioTIP41 (homólogo a TIP41 de levadura, represora de la vía TOR). La secuenciacodificante del dominio GAF y de la versión entera se expresó en formarecombinante en Escherichia coli y las proteínas recombinantes sepurificaron y caracterizaron. Para la evaluación de la actividad enzimática se utilizó un sistema enzimático acopladoutilizando MetSO y triparredoxina I como sustrato reductor. Además, paraevaluar la función del dominio GAF se trabajó con lacepa triple mutante GY202 de S. cerevisiae (carente de la actividad MSRy auxótrofa en Met), pudiéndose observar que tanto la proteína entera como eldominio GAF libre son activos in vivo.En forma similar se evaluó la posible actividad funcional del dominio TIP41 porcomplementación de una cepa Δtip41 de levadura. En línea con estoúltimo, a través de un ensayo de doble hibrido en levaduras, pudimos determinarque tanto el dominio TIP41 como la proteína entera es un interactor de TAP42 deT. cruzi. Para profundizar los estudios funcionales se propuso lageneración de líneas establecidas de epimastigotes sobreexpresantes de losdominios GAF y TIP41 de la fMSR y dela proteína TAP42. Se evaluó latolerancia a benznidazol, nifurtimox, H2O2 y GSNO,mediante titulación con Alamar Blue. Los resultados obtendidos mostraron quelas líneas sobreexpresantes en el dominio GAF y en TAP42 presentaron mayortolerancia al benznidazol, nifurtimox y H2O2.Contrariamente, para el GSNO, estas mismas líneas celulares mostraron ser mássensibles que la línea control. En línea con esto, mediante ensayos de western blot contra muestras de estosparásitos mostraron que las líneas sobreexpresantes en el dominio GAF y enTAP42 poseen un mayor nivel de la cPx y de la SOD A con respecto al control.Estos resultados indicarían que la sobreexpresión del dominio GAF y TAP42genera una modulación de los niveles de otras proteínas antioxidantes, lo quepodría llevar a la mayor tolerancia aparente a condiciones de estrés oxidativo. En adición, pudimos observar que lasobreexpresión de TAP42 y del dominio GAF induce a una mayor velocidad dediferenciación de epimastigote a trypomastigote metaciclico, contrariamente aldominio TIP41 que reprime el proceso de diferenciación. Los resultadosexpuestos sugieren que la TcfMSR es un posible vínculo entreel metabolismo redox y la vía TOR en T. cruzi.