Probióticos nativos y producción agroecológica: inhibición de microorganismos zoonóticos de alta relevancia en agricultura familiar

VIALE MN; B. IMPERIALE; LARZABAL M; ROMANI MI; KOCIUBINSKI G

jujuy

Congreso; 2° Congreso del Foro de Universidades Nacionales para la Agricultura Familiar (FUNAF); 2015

FUPAU

PROBIÓTICOS NATIVOS Y PRODUCCIÓN AGROECOLÓGICA: INHIBICIÓN DE MICROORGANISMOS ZOONÓTICOS DE ALTA RELEVANCIA EN AGRICULTURA FAMILIARViale MN1*; Imperiale B1; Larzabal M1; Romano MI1; Kociubinski G21 Instituto de Biotecnología, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA).2 Centro de Investigación para la Agricultura Familiar (CIPAF) Región Pampeana, INTA.*Autor corresponsal: viale.mariana@inta.gob.arIntroducción: En contraposición a los antibióticos sintéticos, los probióticos son microorganismos considerados seguros para el consumo humano y animal, apreciados por sus efectos positivos sobre la salud, y por no generar resistencia. Dentro de los microorganismos probióticos, la gran mayoría pertenecen al grupo de las bacterias ácido lácticas (BALs), las cuales despliegan un gran arsenal de metabolitos con actividad antimicrobiana (ácidos orgánicos, diácetilo, peróxido de hidrogeno, bacteriocinas, etc.), responsables de la inhibición de un amplio espectro de microorganismos patógenos, pero sin desarrollar resistencia como en el caso de los antibióticos. La producción porcina, muy difundida entre los Agricultores Familiares, contribuye en gran medida a las economías regionales, siendo esencial el control sanitario de la unidad productiva para garantizar la sustentabilidad e inocuidad de los productos derivados, y la salud del productor y su familia. Entre las enfermedades zoonóticas, las gastrointestinales son las de mayor incidencia en los planteles porcinos, con gran impacto económico negativo fundamentalmente por su alta morbilidad y mortalidad en las categorías jóvenes. El manual para el control de enfermedades porcinas emitido por SENASA destaca la gran relevancia zoonótica y productiva de la tuberculosis, causada por Mycobacterium bovis y Mycobacterium avium subsp. hominissuis, quienes pueden ingresar por vía digestiva (lácteos contaminados, residuos de cocina y mataderos, excreta de aves y bovinos tuberculosos, etc.). M. bovis pertenece al complejo M. tuberculosis y es también el agente causal de la tuberculosis bovina, mientras que M. hominissuis pertenece al complejo M. avium y es un patógeno oportunista que se encuentra libremente en la naturaleza, y puede ser aislado del agua, tierra, plantas, etc. Tanto M. bovis como M. hominissuis son patógenos zoonóticos, con lo cual la falta de control puede significar un gran riesgo para la salud pública. Otra micobacteria de interés pecuario es M. avium subsp. paratuberculosis, también perteneciente al complejo M. avium. Esta bacteria produce una enteritis granulomatosa crónica principalmente en rumiantes, con lo cual es de gran impacto en la producción bovina, caprina y ovina. Otro patógeno intestinal zoonótico a tener en cuenta en las prácticas agrícolas son algunos tipos de Escherichia coli, que produce diarrea acuosa (y sanguinolenta en algunos casos) en niños y personas mayores y ha sido responsable de varios brotes a nivel mundial. La variante enteropatogénica (EPEC) de E. coli es un patógeno de alta relevancia en producción pecuaria a nivel global, componente habitual de la flora intestinal y que se libera en grandes cantidades con las heces. La fuente principal de contagio humano es a través de alimentos, los cuales pueden ser contaminados durante el proceso de faena de los animales reservorio (bovinos, cerdos, aves).Objetivo: Con el objetivo de desarrollar una fórmula probiótica destinada a reducir el empleo de antimicrobianos sintéticos en producción pecuaria, se estudió la inhibición in vitro de cepas de Mycobacterium (M. hominissuis y M. paratuberculosis) y EPEC (E. coli enteropatógena), por BALs nativas-autóctonas aisladas de heces porcinas provenientes de diferentes unidades productivas.Metodología: En este estudio se utilizaron 20 de 82 (25%) cepas BALs nativas pre-seleccionadas por su alta inhibición frente a Salmonella spp. (15 cepas multiresistentes a antibióticos normalmente utilizados en producción pecuaria, aisladas de porcinos y aves), y caracterizadas por sus propiedades probióticas (resistencia a la bilis, pH y antibióticos, adherencia a muscina y células intestinales Caco-2, compatitibilidad y auto-agregación). Las 20 cepas de BALs fueron crecidas en medio MRS durante 24hs a 37°C. Las bacterias contra las cuales se evaluaron las BALs se crecieron en agitación a 37°C, cada una en su medio adecuado. Una cepa de M. hominissuis aislada de un humano con micobacteriosis del Hospital Dr. Antonio Cetrángolo se creció durante una semana en medio 7H9-glicerol con agregado de 10% de ADC, mientras que M. paratuberculosis K-10 (cepa de referencia) lo hizo en dos semanas en el mismo medio con agregado de 2mg/ml de micobactina J. E. coli EPEC E2348/69 del serotipo O127:H6 (también cepa de referencia) se creció toda la noche en medio LB. Una vez crecidas las 3 cepas, se llevaron a una densidad óptica a 600nm de 0,5 y se dispensó 1ml de cada una en 21 tubos de 1,5ml. Todos los tubos se centrifugaron 1min a 14000 rpm y se retiró el sobrenadante, el cual se reemplazó por 1ml de los 20 sobrenadantes de cultivo libres de células de las BALs, más un control con medio MRS. Se monitorio durante 6hs la aparición de algún cambio macroscópico en las suspensiones de bacterias y a tiempo final se sembraron diluciones seriadas de las mismas en medio sólido adecuado para explorar su viabilidad luego del tratamiento. Resultados: Durante el monitoreo de las suspensiones bacterianas (21 tubos por cada uno de los 3 patógenos) se observaron los cambios macroscópicos que podrían sufrir. En el caso de M. paratuberculosis, se vio un efecto instantáneo (menos de 5 minutos) donde las bacterias se comenzaron rápidamente a nuclear en el centro del tubo y las mismas precipitaron hacia el fondo, formando una especie de coagulo cuyo volumen superaba más de 100 veces el volumen real de las bacterias si estas fueran centrifugadas. Este efecto probablemente se deba a la modificación de las propiedades de la compleja pared micobacteriana, la cual se caracteriza por la presencia de ácidos micólicos. Un efecto similiar, un poco más tardío (alrededor de media hora) se observó en la otra micobacteria ensayada, M. hominissuis. En ambas cepas se observó tal efecto con 19 de los 20 sobrenadantes estudiados. En el caso de E. coli el efecto macroscópico se vio más retardado (entre las 5 y 6 hs) y no fue de las mismas características que el observado en las micobacterias. En este caso, solo se observó con respecto al control, mayor precipitación de las bacterias pero ese precipitado no tuvo forma de coagulo y su volumen no era mayor al volumen de las bacterias centrifugadas. 18 de los 20 sobrenadantes ensayados fueron responsables del efecto mencionado.A tiempo final (6hs), se sembraron diluciones seriadas de las 3 cepas tratadas con un sobrenadante que haya causado efecto a nivel macroscópico y con medio MRS solo (control negativo) y se observó el crecimiento. En el caso de M. paratuberculosis, el control negativo desarrolló un césped de bacterias tanto cuando se sembró en diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000 de la suspensión original, mientras que las micobacterias tratadas con el sobrenadante de cultivo de las BALs no mostró desarrollo en ninguna de las diluciones sembradas, sugiriendo un efecto bactericida del sobrenadante. En el caso de M. hominissuis, al tratar con el sobrenadante de BALs, bajó varios ordenes la carga bacteriana aunque se encontraron 100 unidades formadoras de colonia en la dilución 1/10, contra un césped que creció en el control con MRS en todas las diluciones analizadas (1/10, 1/100 y 1/1000), sugiriendo que esta bacteria sería más resistente que su par analizada. En el caso de E. coli, al igual que M. paratuberculosis, no se encontró ninguna bacteria viable luego someter la cepa de E. coli al tratamiento con el sobrenadante de cultivo de BALs, mientras que el control desarrolló un césped bacteriano en todas las diluciones sembradas.Conclusiones: La relevancia de este estudio consiste en demostrar las ventajas del empleo de probióticos nativos (cepas no comerciales ni modificadas genéticamente, y adaptadas a sistemas productivos específicos), en la reducción del uso de antimicrobianos sintéticos y consecuentemente sus efectos negativos a corto plazo. En base a los resultados obtenidos donde se demostró la eficacia de BALs in vitro para inhibir o reducir la carga de algunos enteropatógenos, se podría asegurar que los microorganismos probióticos utilizados, los cuales fueron aislados a partir de ecosistemas regionales, constituyen una herramienta biotecnológica segura para controlar enfermedades de interés en la agricultura familiar, no solo para prevenir pérdidas económicas, sino también para garantizar la salud del productor que está en constante exposición con los animales y al ambiente contaminado, como así también de los consumidores de los alimentos provenientes de dichas agriculturas.Esta línea de trabajo contribuirá al desarrollo de una producción agroecológica y sustentable, y en la prevención de enfermedades zoonóticas causadas por microorganismos sumamente agresivos y en algunos casos multi-resistentes contra los cuales se dificulta obtener un tratamiento efectivo.