Evaluación de proteínas de proteobacterias rhizobiales no patógenas como antígenos alternativos para el diagnóstico de la brucelosis.

M. VICTORIA DELPINO; CARLOS A. FOSSATI; PABLO C. BALDI

Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina

Congreso; LI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunología.; 2003

Abstract La brucelosis es una enfermedad causada por bacterias del género Brucella, perteneciente a la clase alfa Proteobacteria. La producción de antígenos para el diagnóstico implica la manipulación de brucela viva, con el consiguiente riesgo de infección. Especulamos que las proteínas citoplasmáticas de alfa proteobacterias no patógenas (Agrobacterium sp, Sinorhizobium sp, Ochrobactrum sp) tendrían reactividad cruzada con los antígenos de Brucella y podrían usarse para diagnosticar brucelosis en humanos y animales. Las suspensiones bacterianas fueron centrifugadas y se resuspendieron en Tris-HCl pH= 8 (Tris buffer). Las células se rompieron por dos pasajes por French Press y se centrifugaron. El sobrendante obtenido se ultracentrifugó a 105.000 x g por 4 horas. Una parte de los citosoles se trató con proteinasa K El pellet (membranas) se lavó con buffer Tris y luego se resuspendió en el mismo buffer conteniendo 1 % v/v de Tritón X 100 y 5 mM de EDTA. Se incubó durante 4 hs. a 37 ºC en agitación, se ultracentrifugó a 105.000 x g por 4 horas. Una parte de las membranas se trató con proteinasa K Se evaluó por ELISA la reactividad de sueros de humanos (32), ovinos (75), bovinos (59) y caninos (61) infectados con distintas especies de Brucella frente a las fracciones citosólicas y de membrana. Los valores de corte fueron calculados como la media ± 2 SD de las densidades ópticas específicas (DOe= DO con antígeno – DO sin antígeno) obtenidos con sueron normales (humanos, 20; ovinos, 20; bovinos, 36; caninos, 34). La infección por B. canis fue detectada con alta especificidad (97.6% para Agrobacterium, 93.3% para Sinorhizobium, 100% para Ochrobactrum) y sensibilidad variable (32% para Agrobacterium, 77% para Sinorhizobium, 100% para Ochorbactrum) con todos los ELISAs, y fue posible diagnosticarla tempranamente (15 días p.i.). Se obtuvieron resultados análogos con las fracciones de membrana. En contraste, los sueros normales humanos, ovinos, y bovinos arrojaron altas DOs, y por ende altos valores de corte, generando baja sensibilidad diagnóstica. Para los sueros humanos, los valores de corte fueron 2.550 para Agrobacterium, 1.820 para Sinorhizobium, 1.500 para Ochrobactrum; para ovinos, los valores de corte fueron 1.821, 1.255, 0.856, respectivamente; para bovinos los valores de corte fueron 0.822, 0930, 0.665, respectivamente. Resulados análogos se obtuvieron con las membranas. Los tratamientos con proteinasa K revelaron que los altos valores de DO de los individuos normales correspondían en gran medida a reactividad anti-proteínas. El análisis del patrón proteico por Western blotting, no reveló diferencias en las bandas proteicas reconocidas por los organismos infectados y normales. Estos resultados muestran que los anticuerpos contra proteínas citoplasmáticas y de membrana de proteobacterias no patógenas no tienen valor diagnóstico en la brucelosis de ovinos, bovinos y humanos. Sin embargo, es altamente específica y sensible para el diagnóstico de brucelosis canina y puede detectar la infección por B. canis a cortos tiempos después de la exposisión al patógeno.