Performance comparativa de los ELISAs con proteínas o LPS de B. canis y la aglutinación en el diagnóstico de la brucelosis canina.

PABLO C. BALDI; M. VICTORIA DELPINO; M. MAGDALENA WANKE

Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina

Congreso; III Congreso Argentino y II Congreso Latinoamericano de Zoonosis.; 2001

Abstract La infección canina por Brucella canis produce abortos en las hembras, epididimitis u orquitis en los machos y espondilitis y uveitis en ambos sexos. La bacteria se transmite por diversas vías, siendo la más importante la sexual, por lo cual resulta primordial el control de los animales destinados a reproducción. El control de rutina de la brucelosis canina suele realizarse con la prueba de microaglutinación en placa, en la que se enfrenta el suero problema con una suspensión de B. canis cepa M(-). La suspensión contiene bacterias enteras, por lo que se detectan anticuerpos dirigidos contra antígenos de la membrana externa bacteriana, principalmente lipopolisacárido rugoso (LPS) y proteínas de la membrana externa (OMPs). Aunque por lo general la enfermedad se acompaña de altos niveles de anticuerpos anti-LPS y anti-OMP, la escasa sensibilidad analítica de las pruebas de aglutinación podría determinar la aparición de falsos negativos en períodos en los anticuerpos están presentes en bajo título o en los que predominan los anticuerpos incompletos (no aglutinantes). Hemos observado negativización postratamiento de la aglutinación en animales en los que todavía podía aislarse B. canis en sangre, semen o exudado vaginal. Otra limitación de la prueba de aglutinación es la posible existencia de falsos positivos por reactividad cruzada con el LPS y las OMPs de otras bacterias. El objetivo del presente estudio fue evaluar la performance diagnóstica de la aglutinación en comparación con ensayos de ELISA destinados a la medición de anticuerpos contra componentes de la membrana externa o contra una proteína citosólica de Brucella. Para la medición de anticuerpos contra membrana externa se utilizó un extracto salino en caliente (hot saline –HS-) de B. canis M(-), el cual se compone de LPS y varias OMPs. La proteína citosólica empleada en el estudio fue la lumazina sintetasa de Brucella (LSB) recientemente descripta por nosotros. Se analizaron muestras seriadas de suero de 13 perros involucrados en una epidemia de brucelosis canina que afectó a un criadero. La cohorte se compuso de 3 machos y 10 hembras de entre 2 y 5 años, de los cuales 12 eran de raza caniche y 1 de raza yorkshire. El antígeno HS se preparó por autoclavado de B. canis entera, remoción de las bacterias por centrifugación, ultracentrifugación del sobrenadante y disolución del pellet obtenido en esta última. La LSB se obtuvo en forma recombinante en E. coli. Para el ELISA anti-HS se sensibilizó con 0.5 µg de antígeno por pocillo y para el ELISA anti-LSB con 0.3 µg por pocillo. Los sueros fueron ensayados a dilución 1:200 y para evidenciar los anticuerpos específicos se empleó un suero anti-gglobulinas de perro conjugado a peroxidasa. Para establecer el valor de corte de ambos ELISAs se ensayaron en iguales condiciones 50 sueros de perros normales, tomándose como cut-off a la media más 3 desvíos estándar. La prueba de aglutinación se realizó según el protocolo clásico, mezclando suero con la suspensión de B. canis M(-) y observando la reacción al microscopio. El grado de aglutinación fue calificado entre 0 y 4+ según la experiencia del observador. En la primera muestra, 8 de los 13 animales evaluados fueron positivos francos por aglutinación (2+ a 4+), 4 fueron negativos y 1 exhibió una aglutinación débil. En cambio, todos los animales fueron positivos por ELISA anti-HS (DO= 0,440 a 1,988) y por ELISA anti-LSB (DO= 0,564 a 2,004). En los 4 perros que fueron negativos por aglutinación, la DO superó al cut-off entre 1,45 a 2,80 veces  en el ELISA anti-HS y entre 1,3 a 4 veces en el ELISA anti-LSB. Notablemente, todos los animales inicialmente negativos positivizaron la aglutinación en la muestra siguiente, tomada entre los 15 y los 30 días posteriores a la primera sangría. Durante el seguimiento 4 perros exhibieron escasa variación de sus niveles séricos de anticuerpos anti-HS y anti-LSB, otros 2 mostraron declinación de ambas reactividades, 1 tuvo un notorio aumento de reactividad y 2 exhibieron una declinación inicial de anticuerpos seguida de un posterior incremento. En todos los casos, las variaciones de anticuerpos anti-LSB fueron paralelas a las de anti-HS. Este estudio demuestra que la prueba de aglutinación puede arrojar resultado negativo en perros infectados recientemente por B. canis, llevando a que estos animales no sean separados de la jauría y puedan diseminar la infección. En cambio, los ELISAs con antígeno HS y LSB fueron capaces de detectar la infección desde el comienzo. Ambos ensayos podrían reemplazar a la aglutinación en el control serológico de la brucelosis canina, pero el antígeno LSB ofrece la ventaja de una mayor especificidad que el HS.