Caracterización de fotorreceptores de Nesterenkonia sp act 20 aislada de la puna andina argentina

PORTERO, L.R.; SIMON, J.; FARIAS M.E.; GÄRTNER, WOLFGANG; ALBARRACÍN V. H.

SAN MIGUEL DE TUCUMAN

Congreso; III Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos. GRAFOB DEL BICENTENARIO.; 2016

La Puna de los Andes sudamericanos es considerada un ambiente prístino yhostil para el desarrollo de la vida debido a factores climáticos y del propio suelo.Estos ambientes están sometidos a una elevada radiación solar, una marcadaamplitud térmica y una escasa disposición de agua. Una gran variedad demicroorganismos denominados "extremófilos" habitan estos ambientes, adaptados atolerar una elevada radiación UV, dentro de este grupo de microorganismos se aislóa partir de suelo cercano a la laguna Socompa (Salta, Argentina) la cepa deNesterenkonia sp. Act201,2,3. Estudios previos de nuestro grupo de trabajo del genomade N.Act20 en búsqueda de fotorreceptores, dieron como resultados la presencia deuna fotoliasa, y un criptocromo novel, no reportado en otras Nesterenkonias yadescriptas4,5.El objetivo de este trabajo es estudiar el criptocromo de Nesterenkonia sp.act20, mediante su clonación, expresión y caracterización.Con la disposición del genoma secuenciado de N. Act20, se realizó labúsqueda de fotorreceptores mediante la herramienta ?BLAST?, utilizando comosecuencia consenso los fotorreceptores más estudiados que se encuentran descriptosen la bibliografía. El análisis filogenético de los genes encontrados se realizó usandoel servidor Clustal Omega, (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo). Elcriptocromo de N. Act 20 fue clonado y sobreexpresado usando el vector pET28arecombinante en E.coli BL21 DE3. La caracterización de la proteína se realizómediante espectroscopía de fluorescencia luego de su expresión, purificación yconcentración.Nesterenkonia sp Act20, presentó dos fotorreceptores, en el análisisfilogenético se clasificaron como una fotoliasa clase CPD-III, y un criptocromo FeSBCPs.El criptocromo FeS-BCPs pertenece a una nueva clase de criptocromosbacterianos que contienen un clúster de sulfuro de hierro. En el análisis de lasecuencia de aminoácidos se observó la conservación de sitios característicos, comoel sitio de unión al cromóforo, en este caso el FAD, y en el caso de la fotoliasatambién se observó una unión a un segundo cofactor como el MTHF. El criptocromode acuerdo a la filogenia estudiada debería presentar el sitio de unión para el clústerIII GRAFOB 2016de FeS, sin embargo, esto no se pudo corroborar mediante el alineado ymodelado molecular de la proteína.El Criptocromo presentó un espectro de absorbancia en el cual el cofactorestaría en su estado reducido y el espectro de emisión con excitación a 450 nmmostró un pico a 530 nm, dando indicios de una flavoproteina. Esto fue confirmadopor desnaturalización de la proteína, después de lo cual se obtuvo un característicoespectro de emisión (520 nm) y excitación (450 nm), correspondiente al FAD libreen solución. Se determinó por método químico la presencia de hierro midiendo laabsorbancia a 535 nm en el criptocromo purificado y luego desnaturalizado. Estosresultados permiten confirmar la clasificación del criptocromo de Nesterenkonia spAct 20 dentro de la clase FeS-BCPs.