Desarrollo de un inmunosensor descartable, aplicado en la determinación de anticuerpos IgG específicos para Helicobacter pylori en muestras de suero humano

GERMÁN ALEJANDRO MESSINA; IRMA ESTER DE VITO; JULIO RABA

San Luis, Argentina

Congreso; XXVI CONGRESO ARGENTINO DE QUÍMICA; 2006

Helicobacter pylori es un bacilo patógeno Gram negativo que esta especialmente adaptado para colonizar la mucosa gástrica humana. A pesar de la inducción de fuertes respuestas inmunes locales en la mucosa estomacal del huésped, este microorganismo es capaz de establecer infecciones durante décadas, causando úlcera péptica y gastritis crónica [1]. La infección por H pylori es la causa mas común de la mayoría de las enfermedades ulcerosas no asociadas al uso de medicamentos, como los analgésicos antiinflamatorios no esteroideos (AINES) [2]. Las evidencias que asocian la infección crónica H. pylori y el cáncer gástrico han sido demostradas por estudios patológicos y epidemiológicos [3]. El descubrimiento de H. pylori como el agente etiológico de la mayoría de las ulceras gástricas y duodenales y gastritis no-autoinmunes, ha revolucionado el tratamiento y el manejo de los pacientes, y la terapia antimicrobiana es ahora el tratamiento base para pacientes con enfermedad péptica y diagnostico positivo para H. pylori. La enfermedad puede ser curada por erradicación de H. pylori a través de la aplicación de una triple terapia, compuesta por un inhibidor de la bomba de protones y dos o en algunos casos tres antibióticos (claritromicina, metronidazol y amoxicilina) [4]. Para prevenir el indiscriminado uso de múltiples antibióticos, teniendo en cuenta el alto grado de resistencia al tratamiento, es necesario un diagnostico preciso de la infección por este microorganismo. Los métodos disponibles para diagnosticar la infección por H. pylori pueden ser divididos en: invasivos y no invasivos [5]. Los métodos invasivos utilizan endoscopia para obtener una muestra de biopsia estomacal, la cual es analizada histológicamente y por cultivo en medios selectivos, para demostrar la presencia de H. pylori. De forma alternativa, el test de ureasa positivo realizado sobre la muestra de biopsia indica la presencia de H. pylori, debido a que este microorganismo posee gran cantidad de esta enzima [6]. Entre los test no invasivos se encuentran la prueba del aliento de urea y los métodos serológicos. Algunos test serológicos se basan el la detección de anticuerpos IgG específicos para H. pylori en muestras de suero humano. Los anticuerpos circulantes contra H. pylori son de valor considerable en el diagnostico de infección activa por H. pylori, debido a la correlación entre la presencia de anticuerpos y la colonización de la mucosa gástrica [7]. La metodología mayormente utilizada en la detección de anticuerpos para H. pylori es la técnica de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) [8]. A pesar de que la técnica de ELISA es utilizada en la examinación clínica de rutina, su límite de detección es relativamente pobre cuando el sistema de detección utilizado es espectrofotométrico, lo cual es causa de pérdida de sensibilidad [9]. Los enzimo inmunoensayos heterogéneos acoplados a un sistema de inyección en flujo y detección amperométrica son una poderosa herramienta analítica para la determinación de bajos niveles de analitos, tales como anticuerpos, hormonas, drogas, marcadores tumorales y virus [10]. En general los métodos electroquímicos ofrecen una excelente sensibilidad, rapidez, y poseen la característica de combinar una instrumentación simple y un bajo costo [11]. Este trabajo muestra el desarrollo de un inmunosensor electroquímico con rotación, acoplado a un sistema de flujo continuo, para la cuantificación rápida y sensible de anticuerpos IgG específicos para H. pylori en suero humano. Los anticuerpos presentes en el suero reaccionan inmunologicamente con antígenos purificados de H pylori, los cuales fueron inmovilizados en la superficie de un electrodo de trabajo de laminas impresas de grafito (graphite screen-printed electrodes (GSPE)). Los anticuerpos unidos son cuantificados por un segundo anticuerpo anti cadena γ conjugado con la enzima fosfatasa alcalina (AP). Esta enzima hidroliza la unión fosfato monoester de p-aminofenil fosfato (pAPP), liberando p-aminofenol, el cual fue cuantificado utilizando Voltametría de onda cuadrada de Osteryoung (OSWV) [12]. La corriente obtenida de la oxidación del producto enzimático es proporcional a la actividad de la enzima y consecuentemente a la cantidad de anticuerpo especifico para H. pylori unido a la superficie del disco rotatorio del inmunosensor. METODOLOGÍA Figura 1 El cuerpo principal del inmunosensor fue construido de plexiglass. La figura 1 ilustra el diseño del biosensor (SPE: Screen-printed electrode, RD: Disco rotatorio. Todas las medidas estan dadas en milímetros) el cual contiene el disco rotatorio (parte inferior) y el sistema de detección que consta de un GSPE modificado con antígenos de H. pylori (parte superior del reactor). El disco rotatorio fue construido de Plexiglas y posee una barra agitadora magnética pequeña. La rotación se efectuó con un agitador magnético de laboratorio (Metrohm E649 de Metrohm AG Herisau, Suiza), controlado con un transformador variable de 0 a 200 V de salida y un máximo de amperaje de 7,5 A (Waritrans, Argentina.). Flujo a través de la unidad de reacción/detección C SI EC RE WE AE R D P W Figura 2 Se utilizó una bomba peristáltica (Guisan Minipuls 3 peristaltic pump, Gilson Electronics, Inc. Middleton, WI) para introducir la muestra y parar el flujo a través de la cámara de reacción. La figura 2 ilustra el sistema de flujo y la unidad de detección. P: Bomba. C: Línea de Carrier. SI: Inyección de muestra. W: Desecho. EC: Celda con disco rotatorio y GSPE. WE: GSPE. RE: Electrodo de pseudos-referencia. AE: Electrodo auxiliar. D: Unidad de detección. R:         Registrador.   Inmunoensayo para anticuerpos específicos para H. pylori Las curvas de calibrado fueron realizadas utilizando estándares de un kit de ELISA comercial, una siguiendo las instrucciones del fabricante y la otra haciendo uso de la metodología por nosotros desarrollada. Las concentraciones de anticuerpo IgG específicos para H. pylori fueron detectados por cambios en las medidas de absorbancia a 450 nm y por técnicas electroquímicas respectivamente. Preparación de los antígenos de H. pylori. Los antígenos fueron preparados por sonicado de un cultivo de H. pylori [13]. Este fue realizado en un medio Agar Mueller-Hinton con 5% sangre carnero y fue incubado a por tres días a 37ºC. Las colonias obtenidas fueron recolectadas, lavadas, centrifugadas y resuspendido en buffer. Sobre esta preparación fue aplicado el sonicado. Síntesis de pAPP La síntesis de pAPP por hidrogenación catalítica de pNPP fue realizada siguiendo el procedimiento propuesto por AG Gehring y col [12] con modificaciones. El producto pAPP presento una pureza mayor al 98 % y fue determinado por NMR. Preparación del inmunosensor Sobre la superficie del electrodo de trabajo fueron inmovilizados los antígenos de H. pylori por absorción pasiva. RESULTADOS El método desarrollado fue aplicado en la determinación de de anticuerpos IgG específicos para H. pylori en 25 muestras de suero humano. Las muestras de suero fueron diluidas 1/100 en PBS, pH 7.2 y luego 20 μl de muestra fueron inyectados en el sistema e incubados por 10 min a 37°C en condiciones de flujo fue detenido. Se realizo una curva de calibrado para el método propuesto, siguiendo el protocolo anterior, con una serie de estándares que cubrieron un rango clínicamente pertinente (0-100 U m1-1), los cuales fueron abastecidos con el kit de ELISA. Las determinaciones electroquímicas del producto enzimático pAP se realizaron a 37ºC en buffer DEA. El comportamiento electroquímico del producto de hidrólisis (pAP) del sustrato enzimático pAPP, fue examinado por voltametría cíclica utilizando GSPE. El estudio consistió en realizar un voltamograma cíclico de 1.0×10-3 mol l-1 de pAP en buffer DEA, (pH 9.6), barriendo el potencial desde - 300 a 500 mV vs Ag /AgCl. La precisión del método propuesto fue chequeada con estándares de 20, 50 y 100 U ml-1 de anticuerpos IgG específicos para H. pylori. La precisión del ensayo se verifico realizando cinco medidas para cada muestra de suero. Esta serie de análisis fue repetida por tres días consecutivos para estimar la precisión entre los análisis. La reproducibilidad del ensayo fue estudiada a partir de un estándar de 20 U ml-1 de anticuerpos específicos para H. pylori (n= 6), el porcentaje de error estándar fue menor al 3%. Tabla 1. Ensayos de reproducibilidad analizando, en forma repetida (n= 6), un estándar de 20 U ml-1 de concentración de anticuerpos específicos para H. pylori.       Tabla 1 Estándar de  20 U ml-1 método propuesto (U ml-1) ELISA  (U ml-1) 1 20.18 21.43 2 19.87 19.37 3 20.42 20.47 4 19.78 19.74 5 19.83 20.92 6 20.24 21.86 a X + SE 20.06 ± 0.107 20.63 ± 0.393 SD 0.262 0.963 Conclusiones En este trabajo se aprovechó la simplicidad del sistema ELISA para construir un inmunosensor capaz de medir los mismos niveles de anticuerpos específicos para H pylori, en muestras de suero humano, que los detectados por los métodos convencionales, teniendo la ventajas de mayor límite de detección, velocidad y simplicidad. En la práctica, el inmunosensor desarrollado funciono como una unidad rápida, sensitiva y selectiva de detección cuando es incorporado en un sistema FIA. Permitió minimizar el gasto de costosos antígenos y reactivos; mostró estabilidad física y química, baja corriente de fondo, amplio rango de potencial de trabajo y no requiere personal altamente capacitado ni equipamientos sofisticados. La detección electroquímica fue realizada dentro de 1 min, y el tiempo total de análisis no excedió los 25 min. Referencias [1] B.J. Marshall, J.R. Warren, Unidenti.ed curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration, Lancet 8390 (1984) 1311–1315. [2] M.J. Blaser, The bacteria behind ulcers, Sci. Am. 274 (1996) 104–107. [3] J.G. Fox, P. Correa, N.S. Taylor, N. Thompson, E. Fontham, E. Janney, M. Sobhan, B. Ruiz, F. Hunter, High prevalence and persistence of cytotoxin-positive Helicobacter pylori strains in a population with high prevalence of atrophic gastritis, Am. J. Gastroenterol. 87 (1992) 1554–1560. [4] W.A. de Boer, G.N.J. Tytgar, Treatment of Helicobacter pylori infection, Br. Med. J. 320 (2000) 31–34. [5] A.F. Cutler, F. Havstad, C. Ma, M. Blaser, G.I. Perez-Perez, T. Schubert, Accuracy of invasive and noninvasive tests to diagnose Helicobacter pylori infection, Gastroenterology 109 (1995) 136– 141. [6] P.R. Hawtin, A.R. Stacy, D.G. Newell, Investigation of the structure and localization of the urease of Helicobacter pylori using monoclonal antibody, J. Gen. Microbiol. 136 (1990) 1995–2000. [7] G.I. Perez-Perez, W.R. Brown, T.L. Cover, B.E. Dunn, P. Cao, M.J. Blaser, Correlation between serological and mucosal inammatory responses to Helicobacter pylori, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1 (1994) 325–329. [8] A.R. Stacy, G.D. Bell, D.G. Newell, The value of class and subclass ELISAs and antibody speci.city in monitoring treatment of Helicobacter pylori, in: G. Gasbarrini, S. Petrolani (Eds.), Basic and Clinical Aspects of H. pylori Infection, Springer, Berlin, 1998, p. 159. [9] A.M.G. Bosch, H. Van Hell, J. Brands, R.H.W.M. Schuurs, in: S.P. Pal (Ed.), Proceedings of the International Symposium on Enzyme Labeled immunoassay of Hormones and Drugs, Walter de Gruyter, Berlin, 1978, pp. 175–187. [10] G. Gu¨ bitz, C. Shellum, Flow injection immunoassays, Anal. Chim. Acta 283 (1993) 421–428. [11] Andrew G. Gehring, C. Gerald Crawford, Ralph S. Mazenko, Lisa J. Van Houten, Jeffrey D. Brewster, Enzyme-linked immunomagnetic electrochemical detection of Salmonella typhimurium  Journal of Immunological Methods 195 (1996) 15-25. [12] J.A. Turner, J.H. Christie, M. Vukovic, R.A. Osteryoung, Anal.Chem. 49 (1977) 1904. [13] Continuous-flow/stopped-flow system using an immunobiosensor for quanti.cation of human serum IgG antibodies to Helicobacter pylori, Germán A. Messina, Angel A. Torriero, Irma E. De Vito, Roberto A. Olsina, Julio Raba Analytical Biochemistry 337 (2005) 195–202