Resultado preliminares de una metodología para la determinación de las isoenzimas de fosfatasa alcalina circulantes en plasma

GUGLIELMI C; BRUN LR; RIGALLI A

Córdoba

Congreso; XXVII Reunión Anual de la Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral; 2010

Asociación Argentina de Osteología y Metabolismo Mineral

La fosfatasa alcalina (FA) se encuentra como diferentes isoenzimas en el plasma, siendo las más importantes las isoenzimas ósea (FAo), hepática (FAh) e intestinal (FAi). La actividad de FAo interesa particularmente porque es una medida de formación del proceso de remodelación ósea. Existen diferentes técnicas para su determinación, como el ELISA en el que la simplicidad compite con su alto costo. La medición de actividad pre y post precipitación con lectina también es utilizada. La búsqueda de una técnica rápida y económica, requerimientos de un laboratorio de investigación, motivaron este trabajo. Los objetivos de este trabajo fueron caracterizar las isoenzimas séricas de FA de rata en función de la sensibilidad de su actividad a la temperatura (T), el pH y la concentración de fenilalanina (Phe), plantear un modelo matemático y desarrollar una metodología para medir las actividades individuales de las isoenzimas en una mezcla. Para ello se aislaron FAo, FAh y FAi a partir de sus respectivos órganos en ratas Sprague-Dawley. En cada caso se obtuvo la enzima con los siguientes factores de purificación: FAo 21, FAh 68, FAi 95. Se planteó un modelo que tiene como base un sistema de ecuaciones algebraicas lineales, donde las actividades de FAo, FAh y FAi en plasma son las incógnitas, la actividad total de FA constituye los términos independientes; y los coeficientes son los porcentajes de actividad de cada isoenzima a un dado valor de T, pH y Phe. Se determinó la actividad de cada isoenzima a pH= 8, T= 37ºC, Phe= 0mM y variando en el medio de incubación: a) pH de 6 a 10; b) T de 10 a 45 ºC; c) Phe de 0 a 16 mM. En cada caso se mantuvieron valores constantes de las otras dos variables. Se asignó el valor 100% a la actividad a pH= 8, T=37ºC y Phe=0mM y se calculó el % de actividad para los rangos de pH, T, Phe analizado. Se seleccionó un valor de cada variable investigada donde los % de actividad de cada isoenzima conduzca a una solución única del sistema de ecuaciones: T*= 25 ºC, pH*= 9, Phe*= 8 mM. En una mezcla de las tres isoenzimas a un dado valor de la variable fisicoquímica, la actividad total de la FA (Act) será la suma algebraica de las actividades de cada isoenzima multiplicada por su porcentaje de actividad. La solución de este sistema son los valores de actividad de FAo, FAi y FAh en plasma. Se realizó la medición de la actividad de cada isoenzima en una mezcla artificial de las tres isoenzimas purificadas (90% FAi, 5% FAo, 5% FAh) utilizando la metodología descripta. Los valores de actividad total de FA (expresados en pNFF pmol/L.seg) en las diferentes situaciones fueron: T*(25 ºC)= 2.14; pH*(9)= 9.93; Phe*(8 mM)= 3.25. Se aplicó la metodología desarrollada para obtener la actividad de las isoenzima de la mezcla obteniéndose: FAi: 3.15 pNFF pmol/L.seg (68.12%); FAo: 0.75 (16.18%) y FAh: 0.73 (15.70%). Si bien son resultados preliminares la metodología planteada ha dado valores aceptables. Las ventajas de esta metodología son bajo costo, rapidez, permite distinguir las tres isoenzimas, pudiendo ser ampliado a la medición de otras isoenzimas como la placentaria y renal, con el solo agregado de una nueva variable. Se están llevando a cabo mediciones en plasma en modelos animales con valores modificados de cada isoenzima para perfeccionar la metodología.