Diferentes formas químicas de la fosfatasa alcalina presentes en el intestino de la rata

BRUN, LUCAS RICARDO MARTÍN; MORENO, HILDA; RIGALLI, ALFREDO; PUCHE, RODOLFO

Rosario

Congreso; XXIV Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2004

Sociedad de Biología de Rosario

La fosfatasa alcalina intestinal (PA) es una fosfomonoesterasa que modifica su actividad en presencia de 1,25(OH)2-D3, desconociéndose su papel en el mecanismo de absor­ción del calcio (Ca++). Hemos demostrado que esta enzima liga iones Ca++, modificando en forma bifásica su actividad de acuerdo a la concentración del ca­tión. Con concentraciones menores a 10 mM, su actividad se incrementa con el aumento de la concentración de Ca++ . Si la concentración de Ca++ supera 20 mM su actividad disminuye. Experimentos exploratorios realizando electroforesis en gel de poliacrilamida de la PA tratada con 45Ca y cromatografía sobre Sephadex G100 sugirieron que la enzima podría estar modificando su peso molecular aparente por la exposición al Ca++. El objetivo de este trabajo fue investigar las posibles modificaciones que se producen sobre la PA por el efecto del Ca++. Se purificó a homogeneidad la PA a partir del intestino delgado de ratas. Siguiendo un protocolo convencional, se inoculó a cobayos y se obtuvo un anticuerpo anti-PA. Este anticuerpo se utilizó en combinación con un anticuerpo anti-IgG de cobayo conjugado con peroxidasa para poner en evidencia la presencia de la enzima. Como sustrato de peroxidasa se utilizo 3-amino-9-etilcarbazole (AEC) y como sustratos para determinar la actividad de la PA: p-nitrofenilfosfato (pNFF) o 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP). Se realizaron dos tipos de experimentos: 1) Cromatografía de PA sobre Sephadex G200. Utilizando AEC se detectaron dos fracciones de la enzima a diferentes volúmenes de elución (VE): VE fracción 1 = 13 ml; VE fracción 2 = 21,7 ml. Con pNFF  se determinó que la fracción 2 presenta mayor actividad específica. El tratamiento de la PA con Ca++ 50 mM produjo disminución de la cantidad de proteína de la fracción 2 y un proporcional incremento de la fracción 1, de actividad despreciable. 2)  Electroforesis en gel de poliacrilamida al 7% de PA con y sin calcio. Se realizó transferencia a membranas de nitrocelulosa. Se determinó la presencia de la enzima con AEC y su actividad con BCIP. Se detectaron dos bandas de PA, una de ellas sin actividad (fracción 1) y otra con actividad (fracción 2). La relación de frente (Rf= distancia de migración de la banda/distancia de migración del colorante de frente) de ambas bandas fue: Rf fracción 1 = 0.16; Rf fracción 2 = 0.45. Conclusiones: 1- Existen dos formas moleculares de PA con diferente peso molecular y actividad enzimática. 2- La fracción de mayor peso molecular presenta actividad despreciable. 3- El Ca++ induciría la conversión de la fracción de bajo en la de alto peso molecular