Efecto del tiempo de exposición al calcio y de la concentración de enzima sobre la actividad de la fosfatasa alcalina intestinal de la rata.

BRUN, LUCAS RICARDO MARTÍN; BRANCE, MARÍA LORENA; RIGALLI, ALFREDO; PUCHE, RODOLFO

Rosario

Congreso; XXIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2003

Sociedad de Biología de Rosario

El catión calcio (Ca++) se liga a la fosfatasa alcalina intestinal modificando su  actividad. Cuando la concentración de Ca++ es inferior a 10 mM, estimula la actividad de la enzima. Si la concentración de Ca++ supera 10 mM disminuye la actividad de la enzima in vitro. Experimentos de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) de fosfatasa alcalina tratada con Ca++ radiactivo, demostraron que la enzima con Ca++ ligado tiene menor velocidad de migración que la enzima libre. Estos resultados son compatibles con un aumento del peso molecular de la enzima. Con el objetivo de obtener evidencia adicional sobre el proceso de agregación producido por el Ca++, se investigó el efecto de Ca++ a diferentes tiempos y con distintas concentraciones de enzima. Se midió actividad de la fosfatasa alcalina a tiempo cero y a los 30, 60, 90 y 180 segundos de incubación in vitro con Ca++ (50 mM). El experimento se repitió con cuatro concentraciones de proteína diferente. Se utilizó fosfatasa alcalina purificada del intestino de la rata. La actividad se determinó usando p-nitrofenilfosfato (pNFF) como sustrato y la actividad se expresó en  pmoles de pNFF·seg-1·L-1. Se calculó la variación de la actividad enzimática en función del tiempo (VAE, pmoles pNFF·seg-2·L-1). La actividad de la enzima disminuyó significativamente en función del tiempo para todas las concentraciones de enzima investigada. La disminución de la actividad en función del tiempo fue más evidente a altas concentraciones de proteínas. Fosfatasa alcalina 2.20 mmol.L-1,   VAE 0.1291±0.0445 pmol pNFF.seg-2.L-1, r=-0.82, n=4. Fosfatasa alcalina 1.10 mmol.L-1,   VAE 0.1015±0.0242 pmol pNFF.seg-2.L-1, r=-0.81, n=4. Fosfatasa alcalina 0.55 mmol.L-1,   VAE 0.0662±0.0195 pmol pNFF.seg-2.L-1, r=-0.77, n=4. Fosfatasa alcalina 0.28 mmol.L-1,   VAE 0.0240±0.0103 pmol pNFF.seg-2.L-1, r=-0.71, n=4. Se concluye que: 1)  el efecto del calcio sobre la fosfatasa alcalina intestinal es dependiente del tiempo de exposición al catión. 2) la velocidad de inactivación de la enzima es dependiente de la concentración de proteína para la concentración de Ca++ investigada. Ambas observaciones aportarían evidencia que en el proceso de inactivación podrían estar jugando procesos de difusión y agregación de la enzima, en concordancia con los experimentos en PAGE mencionados en la introducción.