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Hemos demostrado que el calcio (Ca) interactúa con la fosfatasa alcalina intestinal (IAP) de la rata, aumentando su actividad en relación directa con la concentración de Ca en el medio de incubación, cuando dicha concentración no supera 10 mM. En tales condiciones fija 8 iones Ca por molécula con una constante de afinidad de K=18 mM-1. A concentraciones de Ca mayores a 20 mM la actividad decrece como función de la concentración del catión, produciendo inhibición no competitiva, con agregación molecular, compatible con la formación de trímeros. Ambas formas moleculares existen en ausencia de Ca, aumentando la concentración de la forma agregada y disminuyendo la del monómero a concentración de Ca 50 mM (Brun LR, J Enzyme Inhib Med Chem 2006). Si bien los experimentos detallados fueron realizados con enzima purificada no es posible asegurar que las formas agregadas estén formadas por un sólo tipo de monómero. Se desconoce el impacto de estos cambios en el mecanismo intestinal de absorción de Ca. El objetivo de este trabajo fue calcular el valor del punto isoeléctrico (pI) de la IAP y sus formas moleculares agregadas obtenidas por interacción con Ca así como evaluar la estabilidad de la interacción a un pH donde la carga neta de la IAP es cero. Se utilizó electroforesis bidimensional, que permite evaluar simultáneamente el pI y el peso molecular de proteínas. Se utilizó IAP purificada del intestino de ratas adultas normales con dieta normocálcica. El isoelectroenfoque (IEF) de la proteína se realizó en geles de poliacrilamida 5% con gradiente de pH de 3.5 a 9.5. Como patrones de pI se utilizaron rojo de metilo (pI 3,8), inhibidor de tripsina (pI 4,5), albúmina sérica bovina (pI 5), anhidrasa carbónica (pI 6). Se realizó el IEF (n=4) de IAP con las concentraciones de Ca indicadas en tabla y por Western blot se determinó el pI. A las calles con 0 y 50 mM se les realizó una electroforesis en geles de agarosa (1%) en dirección transversal a la migración del IEF. Como patrones de peso molecular se utilizaron fibrinógeno (341 kDa), gamaglobulina bovina (160 kDa), albúmina sérica bovina (60 kDa), inhibidor de tripsina (21 kDa). Luego de la electroforesis en agarosa se transfirieron las proteínas a una membrana de nitrocelulosa. La ubicación de los patrones de peso molecular fue determinada por tinción con Rojo Punceau. Posteriormente se realizó el revelado con anticuerpo primario anti-IAP de rata, anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y DAB como sustrato. El pI de IAP fue significativamente mayor en presencia de Ca (Tabla, ANOVA, p<0,05) Ca mM pI 0 4.35±0.02 0.023 0.1 4.59±0.02 1 4.68±0.03 5 4.78±0.02 10 4.80±0.06 50 4.82±0.06 100 4.85±0.04 No se halló diferencia entre las masas molecular de las formas agregadas (B1) y entre los monómeros (B2), pero si en el porcentaje de proteína (%)de cada una de ellas en ausencia o presencia de Ca 50 mM. Ca 0 mM B1=469±33 KDa (cantidad de proteína en la banda: 62%) y B2=162±13 (38%), con Ca 50 mM B1=441±62 (87%) y B2=168±39 (13%). Si bien la presencia de Ca modificó la proporción monómero dímero, ambas formas tuvieron el mismo pI con Ca 0 mM (4.35±0.02) y con Ca 50 mM (4.85±0.06). Conclusiones: La presencia de Ca aumenta el proceso de agregación de la IAP y produce un aumento del pI posiblemente por neutralización de sus cargas siendo este fenómeno concentración dependiente. El enfoque de la IAP a esos valores de pH indica que el cambio de la carga de la proteína no es consecuencia de la unión de Ca a grupos que pudieran modificar su grado de ionización por el cambio de pH. El mismo pI para la enzima y su forma agregada a las concentraciones de Ca investigadas, aporta evidencia a favor que estas formas agregadas estarían constituidas solamente por IAP y que la misma no sufriría cambios estructurales importantes.

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