Modificación de la actividad de la fosfatasa alcalina intestinal y su relación con la cinética de absorción de calcio en la rata

BRANCE ML; BRUN LR; DE CANDIA L; RIGALLI A; PUCHE RC

Rosario

Congreso; XXV Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2005

Sociedad de Biología de Rosario

La fosfatasa alcalina intestinal (FAI) liga cationes calcio (Ca++), fenómeno que produce in-hibición no competitiva de su actividad enzimática. Este efecto depende de la concentración de Ca++ y ha sido demostrado in vitro, con enzima purificada. Dicha inhibición en presencia de Ca++ 50 mM se acompaña de aumento del peso molecular de la enzima y unión de cationes a la enzima. El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto del Ca++ in vivo sobre la actividad y la expresión de la FAI de la rata. Se utilizaron ratas IIM/FcM sublínea “m” adultas de 200 g. Se aisló una porción del intes-tino mediante una ligadura a nivel del píloro y otra a 10 cm en sentido caudal en la que se colocó un catéter, para introducir la solución a investigar y extraer muestras del contenido duodenal. En cada animal del grupo tratado (n=4) se colocaron 2 ml de una solución con-teniendo glucosa 160 mM, CaCl2 50 mM, 4 Ci de 45Ca++, Tris 25 mM, pH 7 y el grupo control (n=4) recibió 2 ml de la misma solución en ausencia de CaCl2. Se extrajeron muestras de la solución de la luz intestinal cada 10 minutos durante 80 mi-nutos y se determinó la concentración de Ca++ a través de la medida de 45Ca++ en la luz in-testinal utilizando un contador de centelleo líquido. En cada uno de los tiempos menciona-dos se extrajo una porción de 0,5 cm de intestino, se procesaron por técnicas histológicas convencionales y se realizaron mediciones histoquímica de actividad fosfatásica por incu-bación del preparado histológico con 5-Br-4-Cl-3-indolil fosfato e inmunohistoquímica para cuantificar la enzima presente en el borde en cepillo empleando un anticuerpo de cobayo anti-FAI de rata, anticuerpo anti-IgG de cobayo conjugado con peroxidasa y 3-amin-9-etilcarbazol como sustrato. La actividad y la cantidad de enzima del ribete en cepillo se de-terminó sobre imágenes digitales y se expresó como densidad óptica integrada. Con el fin de comprobar el efecto del calcio sobre la actividad enzimática, cortes histológi-cos de las ratas controles fueron incubados en CaCl2 50 mM y cortes de ratas tratadas con Ca++ 50 mM, fueron expuestos a EDTA 0,5 M. En ambos tratamientos se determinó la expresión de la enzima como se detalló anteriormente. La actividad de la enzima en el borde en cepillo en ausencia de Ca++ disminuye en función del tiempo, mientras que en presencia de calcio se mantiene por encima del grupo control durante el tiempo que la concentración de calcio luminal supera 25 mM. El tratamiento con calcio de cortes histológicos controles restaura el valor de actividad enzimática y la exposición al EDTA de los cortes del grupo tratado con calcio, disminuye la actividad a valores que no discrepan de cero. La expresión de la enzima en la membrana no difirió entre los grupos a los diferentes tiempos. La absorción del Ca++ se ajustó significativamente a un modelo biexponencial (r= 0.903) y presentó una cinética rápida para [Ca++]>25 mM y lenta para [Ca++]