Optimización de un modelo de células de la granulosa en cultivos estimulados con bajas concentraciones de progesterona

CATTANEO ML; CHIARAVIGLIO JA; AMWEG AN; SALVETTI NR; REY F; RODRÍGUEZ FM

Esperanza

Jornada; VI Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión; 2018

FCV-UNL

Lasalud animal de los sistemas agropecuarios es crítica para lograr una buenarentabilidad. Se ha observado un incremento de los desórdenes reproductivosconsecuentes a la elevada producción láctea de los últimos años. Una importante causa de subfertilidad en el bovino esla enfermedad quística ovárica (COD). Esta enfermedad se caracteriza por eldesarrollo de un folículo persistente, con diámetro superior al ovulatorio, quefalla en ovular. La patogenia de esta enfermedad es compleja e involucra untrastorno plurifuncional del proceso de la ovulación. Entre los factores queintervienen en el desarrollo la COD, se ha demostrado que las concentracionessubluteales de progesterona (P4) alteran la pulsatilidad de LH, inhibiendo elpico preovulatorio de la misma. De esta manera se inhibe la ovulación,provocando el crecimiento y persistencia de folículos dominantes, reduciendo lafertilidad. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelode persistencia folicular en bovinos lecheros que consiste en la administraciónde bajas dosis de P4 utilizando un dispositivo intravaginal2. Eneste modelo in vivo se determinó que el tratamientocon progesterona inhibe el pico preovulatorio de LH en las vacas tratadas yaltera los niveles de 17β-estradiol (E2), P4, 17-hidroxiprogesterona ytestosterona en suero y líquido folicular, similar a lo observado en vacas conCOD.Eneste trabajo, nos propusimos optimizar un modelo en una línea de células de la granulosabovina (BGC-1) estimuladas con bajas concentraciones de P4, similar a lasencontradas en folículos persistentes. El objetivo de este desarrollo es contarcon un sistema in vitro para luego estudiar la modulación de diferentesfactores y comprender los efectos de alteraciones que no pueden desarrollarsein vivo. Para ello, se analizará la estimulación con P4 a niveles sublutealesanalizando la expresión del receptor de la hormona luteinizante (RLH) mediantewestern blot y se analizarán las concentraciones de E2 en los sobrenadantes decultivos mediante electroquimioluminiscencia (ECLIA) para comprobar larespuesta del estímulo. Lascélulas BGC-1, cedidas por el Dr. Lino Barañao del Instituto de Biología yMedicina Experimental (IBYME, CONICET), se cultivaron en un medio DMEM:F12(Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB, Internegocios) y 1% deantibiótico (Atb, Gibco) según técnicas ya descriptas1. Al alcanzarel 80% de confluencia en un frasco T75, se realizó en recuento celular encámara de Neubauer con el colorante de exclusión azul de Tripán. En placas de24 pocillos, se sembraron 35.000 células/pocillo con un medio DMEM:F12 10% SFB1% Atb y suplementado con diferentes concentraciones de P4: 0,1; 1, 10 ng/mlpor 24, 48 y 72 h. Se incorporaroncontroles sin P4 en los tiempos estudiados.Luegode las correspondientes incubaciones, los sobrenadantes de cultivo sealmacenaron a -80°C hasta su medición hormonal. Por otro lado, las células se lisaroncon buffer RIPA con inhibidores de proteasas al 10% y se almacenaron a -80°Chasta su posterior análisis por western blot. Serealizaron electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE)al 10% y transferencia a membranas de nitrocelulosa para analizar la expresiónde RLH y de β-actina como control endógeno. En los SDS-PAGE, se sembraron 40 µgde muestra por calle, cuya concentración fue determinada previamente medianteun método de Lowry modificado (BIO-RAD). Laexpresión del RLH se detectó con un anticuerpo monoclonal cedido por Bukovsky(Universidad de Tennessee) en una dilución 1:150 siguiendo el protocolo yadescripto3. Se realizó la normalización del western blot con β-actina(dilución 1:1500, Santa Cruz). La cuantificación del RLH se realizó mediante análisisdigital de imágenes con el programa informático IMAGE PRO PLUS 3.0, evaluandola densidad óptima integrada (IOD). Los diferentes parámetros cuantificadosfueron evaluados estadísticamente con el programa SPSS 10.1 (SPSS Inc. USA)mediante un ANOVA y post- test de Duncan para los valores analizados.Losdatos preliminares obtenidos se observan en las figuras I y II. En las célulassometidas a niveles de P4 correspondientes a 10ng/ml por 48h de cultivos sedeterminó un incremento de la expresión del LHR (Figura I). De esta manera secorroboró la respuesta frente al estímulo de la P4 en las células estudiadas. Los resultados hormonales mostraron una disminución de laconcentración de E2 en el sobrenadante de cultivos obtenido a las 48 h correspondientesal estímulo con P4 de 10ng/ml (Figura II). Estos datos son coincidentes con loobtenido en el modelo in vivo, donde se observó una disminución del E2 en líquidofolicular de animales con persistencia folicular. Con estos datos preliminares podemos concluirque el cultivo de la línea celular BGC-1 sometidas a un estímulo por 48h con P4a niveles subluteales (10ng/ml) podría ser útil como modelo in vitro depersistencia para estudiar factores que no se podrían analizar in vivo enanimales de experimentación, tales como el silenciamiento de diferentes genesentre otros análisis.