Optimización de la evaluación inmunohistoquímica de la proliferación de células en cultivo mediante la incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU)

REY F, STOKER C, CLAUS JD, LUQUE EH

UNL, Sanya Fe

Jornada; V Encuentro de jóvenes investigadores de la UNL; 2001

Universidad Nacional del Litoral

La proliferación celular puede evaluarse identificando células en fase S (síntesis del ADN) del ciclo de división celular. Esta fase puede determinarse por incorporación al ADN de timidinaH3 o BrdU. La BrdU incorporada se identifica con anticuerpos (Ac) específicos y un sistema que revele esta reacción. Nuestro objetivo fue optimizar la determinación de la proliferación celular por incorporación de BrdU en cultivos in vitro de células de insecto de la línea IPLB-Sf21. Se evaluó: a) diferente exposición (0, 30 y 60 min) de las células a la BrdU (10mM), b) fijadores (10% formol-buffer pH 7,5; metanol; etanol) temperatura (ambiente, 4ºC y -20ºC) y tiempo (10 y 20 min), c) recuperación antigénica y apertura del ADN (microondas e hidrólisis ácida), d) incubación con el Ac primario anti-BrdU (clon 85-2C8, 1/100) (1 y 14 hs). Se probaron dos Ac anti-ratón-biotinilados (cabra y equino) ambos revelados por streptavidina-peroxidasa y diamiobencidina/H2O2. Se realizaron controles negativos (reemplazando el Ac primario por suero normal de ratón) y positivos (tejido con BrdU incorporada). No hubo efectos tóxicos de la BrdU en la concentración y tiempos de incorporación usados. El mejor resultado, basándonos en la morfología celular, marcación específica y menor background, se obtuvo fijando las células con formol-buffer, sin pretratamiento con microondas y empleando anti-ratón-biotinilado de cabra. Esta metodología nos permitirá evaluar la actividad proliferativa de esta línea celular en respuesta al tratamiento con péptidos de supuesta actividad de factores de crecimiento