Alteración en la expresión de las IGFBP-4 y -5 en ovarios de bovinos con enfermedad quística ovárica

RODRÍGUEZ FM; COLOMBERO M; PANZANI CG; DÍAZ PU; SALVETTI NR; ORTEGA HH; REY F

Jornada; XIII Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas 2012 de la Facultad de Ciencias Veterinarias-UNR; 2012

La enfermedad quística ovárica (COD) es uno de los desórdenes reproductivos más frecuentes en el ganado bovino lechero de alta producción (3). Se caracteriza por la persistencia de uno o más folículos anovulatorios en ausencia de tejido luteal viéndose afectada la normal ciclicidad de la hembra. El sistema IGF regula el desarrollo folicular y esteroidogénesis solo o en sinergia con gonadotrofinas. Está compuesto por 2 ligandos (IGF-I y II), 2 receptores específicos (IGFR-I y -II), una familia de 6 proteínas de unión (IGFBPs) y proteasas IGFBP-específicas (1). La biodisponibilidad de estos ligandos está controlada por su asociación a las IGFBPs que pueden inhibir o facilitar la acción de los mismos (4). La hipótesis de trabajo, basada en resultados obtenidos previamente, plantea que las IGFBPs proveen un mecanismo regulatorio para la biodisponibilidad de los IGFs durante la foliculogénesis y podrían participar en el desarrollo de la enfermedad. Es por ello, que el objetivo del presente trabajo fue evaluar la expresión y localización del ARNm de IGFBP-4 y -5 por la técnica de hibridación in situ en estructuras foliculares controles y provenientes de ovarios de animales con la enfermedad. Se utilizaron muestras de vacas con quistes espontáneos obtenidas a campo (n=10), y muestras de animales experimentales, cuyos ciclos estrales fueron sincronizados previamente, y luego divididos en dos grupos. En uno de ellos, se indujo la enfermedad por medio de la administración de ACTH (n=5), y el otro se mantuvo como grupo control (n=5). Luego de la confirmación del desarrollo de quistes por ultrasonografía se realizó la ovariectomía y se obtuvieron muestras de ovarios que fueron fijadas en formaldehído bufferado 4% y procesadas según protocolos de rutina hasta inclusión en parafina (2). Luego se efectuaron cortes seriados de 4 mm de espesor en condiciones libres de RNAsas, sobre los que se realizó la técnica de hibridación in-situ utilizando sondas biotiniladas para evaluar los niveles y la localización de ARNm. Se realizó  la inactivación de la peroxidasa endógena con H2O2 en metanol 1%, la recuperación antigénica en microondas con buffer citrato (pH6) y el bloqueo de uniones inespecífica con suero normal de cabra para la posterior incubación con la sonda específica biotinilada. La reacción se visualizó utilizando 3,3´ diaminobencidina como cromógeno. Se incluyó en cada ensayo un control negativo, en el que se sustituyó la sonda biotinilada con el buffer de hibridación. Se determinó la expresión de IGFBP-4 y -5 en las células de la granulosa y de la teca interna de folículos de diferentes categorías durante el crecimiento folicular y en estructuras quísticas utilizando un programa de análisis de imágenes (Image Pro-Plus 3.0). Se midió el porcentaje de área marcada para cada capa folicular y las diferencias obtenidas se analizaron estadísticamente con el programa SPSS para Windows 11.0.1. En base a los resultados obtenidos se demostró una disminución en la expresión del ARNm de ambas IGFBPs estudiadas en células de la granulosa de quistes inducidos respecto a folículos en crecimiento (para IGFBP-4: 6,04± 1,62 vs 15,48± 1,01; p<0.05 y para IGFBP-5: 6,42± 0,16 vs 18,39± 2,61; p<0.05, respectivamente lo que podría sugerir una participación de estas IGFBPs en el desarrollo de la enfermedad. No se observaron diferencias significativas en la expresión del ARNm de IGFBP-4 en células de la teca para las diferentes estructuras analizadas. Además, observamos una disminución de la expresión génica de ambas IGFBPs durante el crecimiento folicular, lo que indicaría su participación en el desarrollo y diferenciación folicular, permitiendo una mayor biodisponibilidad de su ligando principal: IGF-I. Se demostró además que sólo las células de la granulosa expresaron el ARNm de IGFBP-5, mientras que para IGFBP-4 se observó expresión en ambas poblaciones celulares. Podemos concluir con estos resultados y estudios previos que alteraciones en las IGFBPs podrían afectar la biodisponibilidad de los IGFs, su participación en el crecimiento folicular y fallas en la normal ciclicidad del ovario, favoreciendo la formación y persistencia del quiste. Las células foliculares podrían modificar su respuesta a las gonadotrofinas alterando el crecimiento, la esteroidogénesis y la regulación del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal, llevando al desarrollo de la enfermedad quística ovárica bovina.