Caracterización de una UDP-Glucosa-Pirofosforilasa de Streptococcus pneumoniae.

BONOFIGLIO L; GARCÍA E; MOLLERACH M

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Microbiología,; 2001

Asociación Argentina de Microbiología

Streptococcus pneumoniae  es un importante patógeno humano y su cápsula polisacarídica es uno de los principales factores de patogenicidad. La enzima GalU (UDP-glucosa pirofosforilasa, UDPG:PP) cataliza la síntesis de UDP-glucosa (UDPG) que es imprescindible para la producción de polisacáridos que contienen glucosa, galactosa y otros azúcares derivados. Previamente hemos demostrado que la inactivación del gen galU en aislamientos de serotipo 1 y 3 produce mutantes incapaces de sintetizar cantidades detectables de polisacárido capsular. Dado que todos los polisacáridos capsulares de neumococo que han sido descriptos poseen azúcares derivados de UDPG, la inactivación del gen produciría mutantes avirulentas. Considerando, además, las notables diferencias estructurales entre la pirofosforilasas eucarióticas y procarióticas hemos propuesto que las UDPG:PP representan un importante blanco para el diseño de nuevas drogas antimicrobianas. La proteína GalU de neumococo fue parcialmente purificada en condiciones nativas a partir de una cepa de Escherichia coli hiperproductora aplicando técnicas convencionales de purificación de proteínas (cromatografía de afinidad a colorantes reactivos y cromatografía de intercambio iónico). La actividad enzimática fue evaluada sobre extractos crudos y luego del proceso de purificación mediante una reacción de reducción de NADP acoplada a la pirofosforólisis de UDPG lo que permitió determinar Km, Vmax para este sustrato, el requerimiento de Mg 2+ para obtener una actividad máxima y la inhibición de la enzima por pirofosfato libre. La cinética enzimática mostró una saturación por sustrato característica de una típica curva de Michaelis Menten. El análisis de la organización transcripcional del gen galU permitió detectar una región compatible con una secuencia promotora —10 extendida. La actividad promotora de la región propuesta fue evaluada a través de construcciones apropiadas en el plásmido pLSE4 (vector utilizado para la detección de promotores que lleva el gen lytA sin promotor). La transformación de S. pneumoniae M31 (D lytA) con la construcción realizada conteniendo la región promotora propuesta permitió recuperar transformantes LytA+, a partir de los cuales se prepararon extractos crudos en los que se confirmó la actividad LytA. Estos resultados permitieron confirmar de manera preliminar la actividad promotora presente en el fragmento clonado en el plásmido pLSE4.