Nanosistemas de baja toxicidad para la entrega de siRNA

ANA P. PEREZ; EDER ROMERO Y MARIA J. MORILLA.

La Rural

Jornada; JorFyBI; 2007

Introducción. El uso de RNA pequeño de interferencia (siRNA) como terapia silenciadora de genes aún no es ampliamente utilizada in vivo debido la incapacidad de lograr que estas moléculas accedan selectiva y eficientemente a las células y órganos blanco. El acceso correcto en tiempo y forma a un blanco intracelular desde la vía sistémica esta obstaculizado por barreras anatomo-fisiológicas extracelulares e intracelulares. En los últimos años se han elaborado diferentes estrategias para sortear estas barreras y lograr el acceso in vivo de los siRNAs con resultados variables. Los dendrímeros son nanopolímeros tridimensionales formados por un core central y una superficie ramificada, clasificados en diferentes familias de acuerdo a su composición, por ejemplo, los dendrímeros PAMAM son polímeros de poliamidoamina, con un core de etilendiamina. Los PAMAM son nanoSistemas de Entrega de Drogas (nanoSED) únicos, ya que poseen mínima polidispersidad, número de grupos superficiales estrictamente definido, y tamaño comprendido en el rango de las unidades de nanometros. Además, son extremadamente solubles y estructuralmente estables en medios acuosos. Debido a estas características y a su carga superficial positiva son potenciales nano-SED de ácidos nucleicos. Materiales y Métodos. Se formaron complejos dendrímero-siRNA estables a partir de la combinación de dendrímeros PAMAM de generación cuatro (G4) y siRNA anti-proteína fluorescente verde (GFP) en distintas relaciones de carga +/-, (G4/siRNA) (1/1, 5/1, 10/1 y 20/1) en buffer Tris pH 7,5 bajo agitación. La complejación se estudió por desplazamiento de bromuro de Etidio unido a siRNA y por retardo electroforético en gel de poliacrilamida 20%, al igual que  la estabilidad del complejo en presencia de RNAsa y suero humano. Se determinó el potencial Zeta de los complejos y el tamaño por dinamic light scattering. La citotoxicidad en células Vero, (fibroblastos) que realizan endocitosis y células J774 (macrófagos) con capacidad de realizar fagocitosis de los complejos, luego de 24 hs de incubación, se estudió por los métodos de MTT  y LDH en función de la concentración de siRNA (50, 100 y 200 nM) y de la relación +/-. También se estudió la citotoxicidad del reactivo de transfección Lipofectamina.. Se determinará la eficiencia de silenciamiento. Resultados. El desplazamiento del agente intercalante Bromuro de Etidio  de la unión con el siRNA a partir de la interacción con dendrímeros evidenció la formación del complejo y se observó que cuando la relación de cargas es 5/1 se alcanza el equilibrio del sistema, ya que se desplaza la máxima cantidad del fluoróforo. Por retardo electroforético también se verificó la formación de complejo a partir de la relación 5/1 y se evidenció su desensamblaje en presencia SDS (detergente iónico). El complejo protegió al siRNA de la acción de RNAsas y permaneció estable ante la dilución en suero humano. El tamaño de los complejos se encuentra en el rango nanométrico y el potencial Zeta es positivo en todos los casos. La citotoxicidad, en ambas líneas celulares, es apreciable sólo cuando la concentración del siRNA es 200 nM y en la mayor relación +/- (20/1), lo que implica una concentración de dendrímeros 1,20 µM. Por el contrario, los complejos con lipofectamina son citotoxicos en ambos tipos celulares cuando la concentración del siRNA es tan sólo de 50 nM y en las células Vero cuando la concentración del siRNA es 100nM. Conclusiones. Los dendrímeros PAMAM G4 forman complejos estables con el siRNA por interacciones electrostática fuertes que se mantienen en presencia de suero humano y protegen al siRNA de la degradación por RNAsas. Éstos complejos no resultaron citotoxicos in vitro en bajas concentraciones de dendrímeros y siRNA; poseen un tamaño en el rango nanométrico y carga superficial positiva, lo que permite proponer a los dendrímeros PAMAM como posibles candidatos para el delivery de siRNA.