Convenio enttre la Rutgers University y el CONICET para el desarrollo del proyecto correspondiente a un proyecto FIRCA-NIH

RAÚL SALOMÓN; PAULA A. VINCENT

2006-01-01

2007-09-01

Química

Prom.Gral.del Conoc.-Cs.Medicas

            El objetivo a largo plazo es entender la estructura, función y maduración del antibiótico de 21 aminoácidos microcina J25 (MccJ25). Los objetivos específicos son: Establecer relaciones estructura-función en la molécula del antibiótico microcina J25. Establecer un sistema in vitro para la maduración de la microcina J25. Metodología aplicada             Objetivo 1: Se hará una mutagénesis sistemática, tanto dirigida como al azar, de la porción del gen estructural que codifica la MccJ25. Se establecerá la capacidad de las células que contengan los plásmidos mutantes para producir MccJ25 mutante en el medio de cultivo en presencia de un plásmido complementario que contenga los genes de maduración mcjBC y el gen de inmunidad mcjD; las moléculas mutantes de MccJ25 serán purificadas y sus funciones antibacteriana e inhibitoria de la transcripción serán establecidas mediante ensayos in vivo e in vitro, respectivamente. Se buscarán además microcinas mutantes activas contra células resistentes a la MccJ25 salvaje también serán buscadas.             Objetivo 2: El precursor de la MccJ25 y las proteínas de maduración McjB y McjC serán preparadas mediante su superexpresión en vectores adecuados y posterior purificación empleando métodos de cromatografía de afinidad. Las proteínas purificadas serán usadas para encontrar condiciones para la maduración eficiente de McjA en MccJ25. Resultados obtenidos                         Mediante mutagénesis dirigida del gen estructural de la MccJ25 se generaron plásmidos en los que cada uno de los codones de la porción del gen estructural que codifica la microcina fueron sustituídos por los otros 19 codones posibles. Sesenta y dos plásmidos mutantes fueron transformados en la cepa DH5 alfa y ensayados en cuanto a su actividad contra Escherichia coli K-12, cepa MC4100. La mayoría de las microcinas mutantes eran inactivas o mucho menos activas que el control. Sólo un péptido variante más potente que la microcina salvaje fue encontrado. Luego investigamos si alguno de estos plásmidos mutantes codificaba un péptido con un espectro antibacteriano extendido. Para ello, células MC4100 transformadas con la librería de mcjA mutagenizado fueron ensayadas en cuanto a su actividad contra especies bacterianas que son naturalmente resistentes a la MccJ25: Salmonella enterica serovar Typhimurium y dos gram-positivos, Listeria innocua and Lactococcus lactis cepa N29800. Ninguno de los péptidos mutantes mostró actividad alguna contra estas bacterias. Tampoco encontramos microcinas mutantes con especificidad alterada, es decir, que fueran activas contra una cepa en la que el blanco de acción de la MccJ25 es resistente al antibiótico. Resultados esperados. Originalidad e importancia del proyecto             Los resultados de los estudios propuestos clarificarán los detalles de la síntesis de MccJ25 y de las relaciones estructura-función, y de la interacción con su blanco de acción, permitiendo elucidar algunos aspectos hasta ahora desconocidos del mecanismo de transcripción.. Los experimentos propuestos abrirán el camino para el diseño de nuevas drogas antibacterianas basadas en la Mccj25 utilizando genes mcjA mutantes. La comprensión de la maquinaria de maduración de la Mccj25 puede permitir el uso de proteínas quiméricas basadas en la MccJ25 para construir nuevos péptidos cíclicos y/o proteínas con propiedades biológicas y farmacológicas potencialmente interesantes.