Caracterización de las células stem/progenitoras del adenocarcinoma mamario murino LM38-LP. Rol del sistema retinoide y la actividad de la proteína quinasa C (PKC)

DAMIAN E. BERARDI; CAROLINA FLUMIAN; MARIA I. DIAZ BESSONE; STÉFANO M. CIRIGLIANO; ELISA D. BAL DE KIER JOFFÉ; ALEJANDRO J. URTREGER; LAURA B. TODARO

Buenos Aires

Congreso; XXVIII Jornadas de Oncología; 2012

Instituto de Oncología "A. H. Roffo"

En los últimos tiempos ha ganado importancia la hipótesis de que las células stem tumorales son las responsables de la quimioresistencia y el fenotipo metastásico de varios tumores mamarios. El modelo celular mamario murino LM38-LP, presenta características similares a los tumores mamarios humanos triples negativos ya que está compuesto por células luminales (LEP), mioepiteliales (MEP) y stem/progenitoras (TMSC). Previamente hemos demostrado que mamosferas (formaciones celulares en suspensión enriquecidas en TMSC) generadas a partir de la línea LM38-LP son capaces de generar in vivo tumores constituidos por las tres estirpes celulares. En el presente trabajo nos proponemos estudiar la morfología de las mamosferas cuando son tratadas con retinoides y/o inhibidores de la actividad PKCa ó d y determinar si estos tratamientos son capaces de alterar la capacidad de regenerar mamosferas secundarias o monocapas LM38-LP. Finalmente evaluamos el perfil de expresión de genes relacionados con el mantenimiento del fenotipo stem. Por microscopia de contraste de fase, pudimos determinar que el tratamiento de las mamosferas con el inhibidor de PKCa (Gö6976 2,5 uM) o su combinación con retinoides (ATRA 1 uM) produce retardo del crecimiento a partir de las 48 hs (Diámetro a las 96 hs: 200 um vs 100 um en células control y tratadas respectivamente). El tratamiento con ATRA redujo el crecimiento significatvamente a partir de las 72 hs de tratamiento (Diámetro a las 96 hs: 200 um vs 150 um en células control y tratadas respectivamente). Las mamosferas pretratadas fueron disgregadas y a fin de evaluar su capacidad de regenerar nuevas mamosferas, una monocapa convencional o Cultivo 3D en Matrigel. La combinación de ATRA con Gö6976 inhibió totalmente la capacidad de formar mamosferas secundarias, mientras el resto de los tratamientos mostró una reducción en la formación de estas estructuras (Porcentaje de formación de mamoesferas respecto del control: Gö6976: 14,81%; Rottlerina y ATRA: 75,30% y ATRA+Rottlerina: 40,70%) y una disminución del diámetro de las mismas. Las células provenientes de las mamosferas pre tratadas, fueron capaces de regenerar monocapas en cultivo con distinta eficiencia (porcentaje de confluencia luego de 10 días de cultivo: control: 90%, ATRA: 70%, Gö6976: 5%, ATRA+Gö6976: 5%, Rottlerina: 70%, ATRA+Rottlerina: 50%). Se observaron distintas morfologías en cultivo en matrigel: Tanto las células Control como las pre tratadas con Rottlerina formaron estructuras desordenadas de gran tamaño con presencia de branching, a diferencia de las células pre tratadas con ATRA o ATRA+Rottlerina que formaron estructuras ordenadas con presencia de lumen. El pre tratamiento con Gö6976 dio lugar a la formación reducida de estructuras pequeñas y con señales de muerte celular. Finalmente, mediante RT-PCR pudimos demostrar que las mamosferas expresan altos niveles de genes de pluripotencialidad como Nanog, Sox2, C-Myc y p16 respecto de la línea original. Además, el tratamiento con Gö6976 o su combinación con ATRA aumentan los niveles de Bax y p53, relacionados a la inducción de apoptosis. Nuestros resultados indican que la línea LM38-LP presenta células con pluripotenicialidad y que la inhibición de la actividad de PKCa conjuntamente con el tratamiento diferenciador del ATRA conduce a la reducción de esta población celular.