Desarrollo de un marcador scar para la detección de Aspergillus ibericus.

GIAJ-MERLERA, G.; MUÑOZ, S.; COELHO, I.; TORRES, A.M.; REYNOSO M.M.

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Micología, XXIII Jornadas Argentinas de Micología y 1era Reunión de la Asociación Micológoca Carlos Spegazzini; 2014

Asociación Argentina de Micología

Aspergillus ibericus es una especie perteneciente a la Sección Nigri, recientemente descripta en España y Portugal que no produce ocratoxina A (OTA) y presenta caracteres morfológicos similares a A. carbonarius. En estudios previos, analizamos la micoflora ocratoxicogénica presente en pasas de uvas y demostramos por primera vez la presencia de esta especie en nuestro país. El objetivo de este trabajo fue diseñar un marcador SCAR (región amplificada caracterizada y secuenciada) a partir de perfiles ISSR-PCR a fin de desarrollar una técnica sensible y confiable para la detección selectiva de A. ibericus. Utilizando el cebador GTC (GAC)5 obtuvimos una banda monomórfica única de aproximadamente 250 pb presente sólo en las cepas de A. ibercius, la cual fue clonada en el plásmido pGEMTeasy vector y posteriormente secuenciada. En base a esta secuencia, se diseñaron un par de cebadores Fibe (CCAACGGTATCACTGGATCA) y Ribe (GACGCAGACGAGTACGAAGA) que amplificaban una región de 189 pb. Tras la optimización del ensayo y condiciones de PCR, se comprobó la especificidad de los cebadores usando diferentes especies de Aspergillus sección Nigri y otras especies fúngicas que cohabitan en diferentes productos agrícolas (Fusarium, Aspergillus y Alternaria). En todas las reacciones se utilizó un control negativo y el control positivo correspondiente. Bajo las condiciones óptimas de PCR: concentración de Mg+2 (1,5 mM), cebadores (0,2 μM), dNTPs (0,2 mM), ADN templado (~ 10 ng) y temperatura de apareamiento (57 ºC), se pudo amplificar un único fragmento de 189 pb en todas las cepas de A. ibericus evaluadas y no se observaron reacciones cruzadas con otras especies fúngicas. La sensibilidad de la técnica permitió obtener un producto de amplificación hasta una concentración mínima de 0,01 ng/μL de DNA total. Este marcador puede distinguir claramente especies de A. ibericus de la especie estrechamente relacionada A. carbonarius de forma rápida, confiable y de bajo costo. Además de otros patógenos fúngicos de plantas, incluyendo diferentes especies de Aspergillus spp. Debido a que A. carbonarius, es conocido por producir altos niveles de OTA, su delimitación con A. ibericus es muy importante para evitar una sobreestimación de los riesgos de contaminación y toxicológicos. Además la incapacidad de A. ibericus de producir OTA es interesante desde un punto de vista biotecnológico debido a que muchos metabolitos con valor comercial se producen por otras especies de la sección