INVESTIGADORES
SEIJO Jose Guillermo
congresos y reuniones científicas
Título:
Estructuración geográfica de la variabilidad cromosómica de las especies de Arachis con genoma A.
Autor/es:
ROBLEDO, G; LAVIA, G.; SEIJO, JG
Lugar:
San Lorenzo, Paraguay
Reunión:
Simposio; VI Encuentro Internacional de Especialistas en Arachis y II Simposio de maní en el MERCOSUR.; 2008
Resumen:
Estructuración geográfica de la variabilidad cromosómica de las especies de Arachis con genoma A.   Robledo G, GI Lavia, JG Seijo*. Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE)-CONICET, C.C. 209, 2400 Corrientes, Argentina. seijo@agr.unne.edu.ar   Introducción La sección Arachis comprende 29 especies silvestres diploides (2n=2x=20, 2n=2x=18) y dos tetraploides, A. monticola y el cultivo A. hypogaea (n.v. maní) (2n=4x=40). El área de distribución de estas especies abarca las cuencas de los ríos Paraguay-Paraná y Uruguay, desde la Chapada dos Parecis en Brasil hasta la costa uruguaya del Río de La Plata. Dos brazos se extienden hacia el norte a través de la cuenca de los ríos Tocantins en Brasil y el sistema Mamoré-Guaporé en Bolivia. Un tercer brazo se extiende hacia el sudoeste hasta las primeras estribaciones de los Andes en el noroeste de Argentina (Krapovickas & Gregory, 1994). Para estas especies se han propuesto tres diferentes genomas (A, B y D) de acuerdo a la morfología de los cariotipos y a la capacidad de cruzamiento de las mismas (Smartt & al., 1978; Singh & Moss, 1982, 1984; Singh, 1986; Stalker, 1991; Singh & Smartt, 1998). La mayoría de las entidades diploides con 2n = 20 se caracterizan por poseer cariotipos simétricos y son asignadas a los genomas A y B por la presencia o ausencia de un par de cromosomas pequeños (cromosomas A), respectivamente. Por otro lado, el genoma D está caracterizado por un cariotipo asimétrico y  ha sido encontrado solamente en A. glandulifera. Para las especies tetraploides se ha propuesto una constitución genómica AABB, mientras que la identidad genómica de las especies diploides con 2n = 18 es aun incierta, aunque han sido provisoriamente asignados al genoma B. Dentro del grupo con genoma A, se reconocen 15 especies que habitan regiones ecológicas muy diversas (Fernández & Krapovickas, 1994, Lavia, 1996, 1999, 2000; Peñaloza & Valls, 2005, Robledo & al., 2008). En ensayos de cruzamientos los híbridos interespecíficos entre la mayoría de las mismas son semifértiles y los cromosomas se asocian formando 10 bivalentes con alta frecuencia (Singh & Moss, 1984). Los análisis moleculares han revelado un alto grado de variabilidad genética dentro de este grupo (Kochert, & al., 1991; Milla, & al., 2005), y diversos rasgos agronómicos de interés han sido observados en algunas especies (Burow & al., 2001; Simpson, 2001, Bertioli, & al., 2003). Por otro lado, varias de ellas han sido consideradas como posibles progenitores o como estrechamente relacionadas a las especies tetraploides (Krapovickas & Rigoni, 1951; Kurmar, & al., 1957; Raman & Kesavan, 1965; Smartt & Gregory, 1967; Gregory & Gregory, 1976; Smart, & al., 1978; Singh, 1986, 1988; Kochert, & al., 1991; Tallury, & al., 2005). Estas características hacen que estas especies constituyan un grupo de interés tanto desde el punto de vista evolutivo como agronómico. La identificación cromosómica en este genoma por técnicas clásicas ha estado limitada a unos pocos pares debido a que las entidades presentan cariotipos altamente simétricos. Asimismo, debido a que las diferencias cariotípicas son mínimas, los estudios de evolución cromosómica, citotaxonomía e introgresión se han visto restingidos a unos pocos caracteres. Por tal motivo, en el presente trabajo se analizaron los patrones de distribución de heterocromatina y la localización de los sitios rDNA por hibridación in situ fluorescente (FISH) en 13 especies con genoma A, con el fin de avanzar en la caracterización de estas especies y establecer las posibles relaciones genómicas existentes entre las mismas.   Materiales y Métodos Preparados cromosómicos. El material examinado fue obtenido del banco de germoplasma del INTA Manfredi (Córdoba, Argentina) y del Instituto de Botánica del Nordeste (Corrientes, Argentina). Para tal fin se utilizaron puntas de raíces de plantas obtenidas a partir de semillas, las cuales posteriormente fueron pretratadas con 2 mM 8-hidroxiquinoleína (Fernández & Krapovickas, 1994), fijadas y subsiguientemente maceradas en una solución de celulasa/pectinasa según Schwarzacher & al. (1980). Los loci para las secuencias repetidas 45S y 5S rDNA fueron localizados usando como sonda: A18S y A25S, dos fragmentos de 1,5 y 3,3 kb, respectivamente, correspondientes a las secuencias de los rRNA 18S y 25S de A. hypogaea fastigiata; y A5S, un fragmento de 0,4 kb correspondiente a una unidad repetida del gen 5S rDNA de la misma especie, incluyendo el espaciador íntergénico adyacente. El pretratamiento de los preparados, la desnaturalización de las sondas, las condiciones de hibridación y lavado post-hibridización, bloqueo y detección indirecta por anticuerpos conjugados con fluorocromos fue realizado de acuerdo al protocolo citado por Seijo & al. (2004). Los cromosomas fueron contrastados por tinción con "Vectashield" conteniendo DAPI, el cual además permitió revelar su patrón de las bandas heterocromáticas. Análisis cariotípico. Para cada especie se analizaron cinco metafases por medio del programa MicroMeasure 3.3. Los cromosomas se clasificaron de acuerdo a su índice centromérico según Levan & al. (1964). Los datos cromosómicos fueron combinados a valores medios, primero entre cromosomas homólogos de una misma metafase y posteriormente entre cromosomas de las distintas metafases analizadas para la especie.   Resultados Todas las especies presentaron bandas heterocromáticas pericentroméricas en los 20 cromosomas del complemento, excepto A. cardenasii, A. chiquitana, A. herzogii y A. kempff-mercadoii que presentaron un par con banda tenue o sin ella. Dichas bandas variaron en intensidad y tamaño entre las especies, siendo las correspondientes a los cromosomas A las más conspicuas en cada caso. En las 13 especies analizadas sólo fueron localizados dos sitios 5S rDNA, siempre en posición paracentromérica. Sin embargo, el número, tamaño y posición de los sitios 45S rDNA fue variable formando patrones característicos para cada especie. Un análisis detallado de los distintos cariotipos permitió determinar distintas homeologías cromosómicas y establecer un patrón de distribución general para estos marcadores. Además, de acuerdo al número y distribución de los sitios 45S rDNA junto con el patrón de bandas heterocromáticas de sus cariotipos, tres grupos de especies pueden ser establecidas. El primero está definido por la presencia de un par con banda heterocromática tenue o sin ella y por tres o cuatro pares de sitios 45S rDNA, e incluye las especies A. cardenassi, A. herzogii, A. chiquitana and A. kempff-mercadoi. Las restantes especies, con bandas heterocromáticas en todos los cromosomas, pueden ser agrupadas de acuerdo al número de sitios 45S rDNA. Así, el segundo grupo incluye a las especies A. correntina, A. duranensis, A, schininnii y A. villosa con dos pares de sitios; y el tercero a las especies A. diogoii, A. helodes, A kuhlmannii, A. simpsonii y A. stenosperma con tres pares de sitios 45S rDNA. Un análisis comparativo de los datos cariotípicos muestra que el primer y tercer grupo son altamente homogéneos considerando la estructura cariotípica general de sus especies; mientras que el segundo grupo es más heterogéneo y cada especie tiene características cariotípicas particulares.   Discusión Este es el primer análisis sobre la localización de los sitios rDNA de las especies A. diogoi, A. helodes, A. herzogii, A. kempff-kercadoi, A. kuhlmannii, A. schininnii y A. simpsoni. Para las restantes especies el número de sitios detectado concuerda en todos los casos, con el mayor número de sitios observados previamente por Raina & Mukai (1999) o por Seijo, & al. (2004). El conjunto de marcadores cromosómicos desarrollados sobre la base del mapeo de la heterochromatina y genes ribosomales ha permitido identificar un mayor número de pares cromosómicos por especie, e identificar patrones cariotípicos particulares para varias de las entidades analizadas. Asimismo, ha permitido el establecimiento de homeologías entre todas las especies del grupo y organizar los cariotipos según la propuesta establecida para el genoma A de A. hypogaea (Seijo & al., 2004). Sobre la base de las homeologías cariotípicas obtenidas se han establecido tres grupos de especies dentro del genoma A. Las entidades incluidas en cada uno de los grupos cromosómicos tienden a estar  distribuidas en áreas geográficas semejantes, pero diferente de las especies incluidas en otros grupos. Así, el primer grupo (Chiquitano) comprende las especies que crecen en el sur y oeste de la región biogeográfica de La Chiquitania (Bolivia). El segundo grupo (cuenca del Río de La Plata) corresponde a las especies distribuidas a lo largo de la cuenca del Río de La Plata (excepto la porción superior del río Paraguay en el Pantanal). El tercer grupo (Pantanal) incluye las especies distribuidas en la región biogeográfica del Pantanal en el centro-oeste de Brasil, norte de Paraguay y este de Bolivia. Algunas de las especies de los grupos Chiquitano y Pantanal presentan distribuciónes simpátricas o parcialmente simpátricas, mientras que todas las especies del grupo Cuenca del Río de La Plata son alopátricas y se distribuyen a lo largo de dos regiones geográficas disyuntas, pero interconectadas por Pilcomayo y Bermejo. La asociación entre distribución geográfica de las especies y las características cariotípicas que presentan las mismas, podría interpretarse como que las especies que comparten una misma región geográfica estarían filogenéticamente más relacionadas que las que habitan regiones diferentes. Esta hipótesis gana sustento al considerar las características reproductivas de las especies del género, ya que la autogamia favorecería la diferenciación en simpatría, mientras que la geocarpia limitaría la dispersión de las entidades diferenciadas favoreciendo la co-distribución de las especies emparentadas.   Bibliografía: Bertioli DJ, Leal-Bertioli SCM, Lion MB, Santos VL, Pappas Jr G, Cannon SB & Guimaraes PM (2003) A large scale analysis of resistance gene homologues in Arachis. Mol Gen Genomics 270:34–45. Burow MD, Simpson CE, Starr JL & Paterson A (2001) Transmission genetics of chromatin from a synthetic amphidiploid to cultivated peanut (Arachis hypogaea L.): Broadening the gene pool of a monophyletic polyploid species. Genetics 159:823-837. Fernández A & Krapovickas A (1994) Cromosomas y evolución en Arachis (Leguminosae). Bonplandia 8:187-220. Gregory WC & Gregory MP (1976) Groundnut. Arachis hypogaea (Leguminosae-Papilionatae). In: Simmonds NW (ed) Evolution of crop plants. Longman Group Ltd, London, pp151-154. Kochert G, Halward T, Branch WD & Simpson CE (1991) RFLP variability in peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars and wild species. Theor Appl Genet 81:565-570. Krapovickas A & Gregory WC (1994) Taxonomía del género Arachis (Leguminosae). Bonplandia 8:1-186. Krapovickas A & Rigoni VA (1951) Estudios citológicos en el genero Arachis. Rev. Invest. Agric. 5:289–294. Kumar LSS, D’Cruz R & Oke JG (1957) A synthetic allohexaploid in Arachis. Current Sci. 26:121–122. Lavia GI (1996) Estudios cromosómicos en Arachis (Leguminosae). Bonplandia 9:111–120. Lavia GI (1999) Caracterización cromosómica del germoplasma de maní. Unpublished D. Phil. Thesis, Universidad Nacional de Córdoba. Argentina. Lavia GI (2000) Chromosome studies of wild Arachis (Leguminosae). Caryologia 53:177-181. Levan A, Fredga K & Sandberg AA (1964) Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas 52:201-220. Milla SR, Isleib TG & Stalker HT (2005) Taxonomic relationships among Arachis sect. Arachis species as revealed by AFLP markers. Genome 48:1–11. Raina SN & Mukai Y (1999) Detection of a variable number of 18S-5.8S-26S and 5S ribosomal DNA loci by fluorescent in situ hybridization in diploid and tetraploid Arachis species. Genome 42:52-59. Raman VS & Kesavan PC (1965) A tetraploid hybrid in Arachis and its bearing on differentiation between diploid species. Indian J. Genet. Plant Breeding 25:80–84. Robledo G, Lavia GI & Seijo JG (2008) Reasignación genómica de Arachis trinitensis (secc. Arachis). VI Encuentro internacional de especialistas en Arachis. San Lorenzo, Paraguay. 1 al 3 de Abril del 2008. Robledo G & Seijo JG (2008) Characterization of Arachis D genome by FISH chromosome markers and total genome DNA hybridization. Genet. Mol. Biol. In Press. Schwarzacher T, Ambros P & Schweizer D (1980) Application of Giemsa banding to orchid karyotype analysis. Plant Syst Evol 134:293–297. Seijo JG, Lavia GI, Fernández A, Krapovickas A, Ducasse D & Moscone EA (2004) Physical mapping of 5S and 18S-25S rRNA genes evidences that Arachis duranensis and A. ipaensis are the wild diploid species involved in the origin of A. hypogaea (Leguminosae). Amer J Bot 91:1294-1303. Simpson CE (2001) Use of wild Arachis species / introgression of genes into A. hypogaea L. Peanut Sci 28:114-116. Singh AK & Moss JP (1982) Utilization of wild relatives in genetic improvement of Arachis hypogaea L. 2. Chromosome complements of species of section Arachis. Theor Appl Genet 61:305-314. Singh AK & Moss JP (1984) Utilization of wild relatives in genetic improvement of Arachis hypogaea L. 5. Genome analysis in section Arachis and its implications in gene transfer. Theor Appl Genet 68:355-364. Singh AK & Smartt J (1998) The genome donors of the groundnut/peanut (Arachis hypogaea L.) revisited. Genet Res Crop Evol 45:113–118. Singh AK (1986) Utilization of wild relatives in the genetic improvement of Arachis hypogaea L. Part 8. Synthetic amphidiploids and their importance in interspecific breeding. Theor Appl Genet 72:433–439. Singh AK (1988) Putative genome donors of Arachis hypogaea (Fabaceae), evidence from crosses with synthetic amphidiploid. Plant Syst. & Evolution 160: 143–151. Smartt J & Gregory WC (1967) Interspecific cross compatibility relationships between the cultivated peanut Arachis hypogaea L. and other species of the genus Arachis. Oléaginuex 22:455–459. Smartt J, Gregory WC & Gregory MP (1978) The genomes of Arachis hypogaea. 1. Cytogenetic studies of putative genome donors. Euphytica 27:665–675. Stalker HT (1991) A new species section Arachis of peanuts with D genome. Amer J Bot 78:630-637. Tallury SP, Hilu KW, Milla SR, Friend SA, Alsaghir M, Stalker HT & Quandt D (2005) Genomic affinities in Arachis section Arachis (Fabaceae): molecular and cytogenetic evidence. Theor Appl Genet 111:1229–1237.  
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