Caracterización de cepas del virus de la laringotraqueítis infecciosa aviar mediante High Resolution Melting Analysis (HRMA).

ROJAS, MARÍA FLORENCIA; KÖNIG, GUIDO; SCOLARO, LUIS; VAGNOZZI, A E; VERA F S ; CRAIG, MARÍA ISABEL

Buenos Aires

Jornada; XXXVI Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Virlogía; 2016

Introducción. Hasta la fecha, la secuenciación es la herramienta más precisa para caracterizar molecularmente las cepas del virus de la Laringotraqueítis Infecciosa Aviar (ILTV). Particularmente, en Argentina se observó que una región del gen US5 que codifica para la glicoproteína J, permite por sí sola discriminar entre aislamientos de campo y cepas vacunales, pudiendo determinar la circulación de 5 haplotipos en el país. En sistemas bien estudiados como este, es posible utilizar otro método como alternativa a la secuenciación. El HRMA es efectivo, rápido y sensible para detectar cambios puntuales en los productos de amplificación por PCR. En esta metodología, el fragmento de interés es amplificado en presencia de un marcador fluorescente en concentraciones saturantes y luego desnaturalizado mediante el incremento gradual de la temperatura. Las variaciones en la secuencia se reflejan directamente en su temperatura de disociación (Tm), por lo que resulta posible asociar cambios nucleotídicos puntuales con variaciones en las curvas de disociación obtenidas.Objetivo. Poner a punto la técnica de HRMA para caracterizar cepas de ILTV de Argentina.Metodología. Las 64 muestras de ILTV analizadas por HRMA provinieron de brotes ocurridos entre 2006 y 2012 en distintas localidades de Argentina y fueron previamente caracterizadas por secuenciación. En el análisis se incluyeron 2 vacunas comerciales, una atenuada en embrión de pollo, y la otra, en cultivo de tejido. Se analizaron dos fragmentos del gen US5 de 137 pares de bases cada uno y se compararon los resultados calculando la concordancia entre HRMA y secuenciación. Finalmente se aplicó el análisis de HRM a 5 muestras positivas para ILTV provenientes de brotes ocurridos en Argentina entre 2013 y 2015. El resultado fue confirmado posteriormente por secuenciación.Resultados. Una vez finalizada la puesta a punto de la metodología en cada uno de los fragmentos, pudieron discriminarse 4 grupos de muestras. Tres de ellos correspondieron a los haplotipos 1, 4 y 5 mientras que el último grupo resultó la combinación de los haplotipos 2 y 3 que no pudieron ser diferenciados uno del otro bajo nuestras condiciones de trabajo. De las 66 muestras analizadas, sólo 1 mostró un perfil variante (no asociado a ninguno de los 4 grupos de haplotipos). Se determinó la concordancia mediante el coeficiente κ de Cohen, el cual estableció que existe 97,49% de coincidencia entre HRMA y secuenciación. Ambas metodologías arrojaron el mismo resultado en las 5 muestras analizadas.Conclusiones. El HRMA se presenta como una herramienta válida al momento de caracterizar muestras de ILTV, cuando esta pertenezca a los haplotipos 1, 4 o 5. Aquellas muestras con perfil coincidente con los haplotipos 2 y 3, serían las únicas seleccionadas para su caracterización definitiva por secuenciación.