OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO DE CLONADO DE LA NUCLEOPROTEÍNA DEL VIRUS JUNÍN

LINERO, FLORENCIA; SCOLARO, LUIS

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología - AAM

La nucleoproteína (N) constituye la principal proteína estructural del virus Junín (JUNV), agente etiológico de la Fiebre Hemorrágica Argentina. Esta proteína presenta una doble función en el ciclo de multiplicación viral: por un lado es esencial en la replicación y transcripción del genoma, ya que actúa promoviendo la síntesis de las formas replicativas (efecto antiterminador), y por otro, estabiliza el ARN genómico constituyendo la nucleocápside viral. Considerando la importancia fundamental de N en el ciclo viral, nuestro estudio se enfocó hacia el clonado de la misma a fin de ser utilizada en la construcción de un vector lentiviral. En el siguiente trabajo se presentan los resultados obtenidos en un estudio comparativo de diversas metodologías con el fin de optimizar las estrategias de aislamiento y clonado de N.El ARN viral se obtuvo a partir de células Vero infectadas con la cepa JUNV IV4454 a una m.i de 0.5 UFP/cél a las 48 hs. p.i. En la extracción de ARN se utilizaron los kits Totally RNA (Ambion) (extracción fenol/cloroformo) y Nucleospin RNAII (Macherey Nagel) (adsorción a columna de sílica). El ARN extraído con el primer método fue retrotranscripto empleando la enzima RT-AMV, mientras que el ARN obtenido con NucleospinII fue retrotranscripto en forma paralela con RT-AMV y SuperScript II. Se comprobó la integridad del cDNA mediante una reacción de PCR utilizando diferentes primers (complementarios a la región genómica que abarca el gen de N) que amplifican segmentos de 186, 587, 736, 1638 y 1700 pb (gen completo) . En el caso de muestras de ARN obtenidas por el método de fenol-cloroformo y retrotranscriptas con AMV se obtuvieron resultados variables, amplificando en la mayoría de los casos sólo los dos fragmentos de menor PM. El método se optimizó cuando se empleó la RT SuperScript II en combinación con el método de extracción de columna de sílica. El fragmento esperado se clonó en pGEM-T-Easy (Promega), secuenciándose los insertos correspondientes a dos colonias positivas.Los datos de secuenciación indicaron que ambos insertos se corresponden con y completan la secuencia parcial de IV4454 publicada en GenBank (NCBI). Habiendo confirmado las secuencias se procedió a la amplificación del fragmento con las modificaciones necesarias para su clonado direccional en pLenti6/V5 TOPO (Invitrogen). A fines comparativos se utilizó como molde el cDNA obtenido con SuperScript II a partir de ARN extraído en columna de sílica y el ADN clonado en pGEM-T-Easy, obteniéndose resultados positivos sólo en este último caso. La ligación se realizó utilizando el producto de PCR directo y purificado por Wizard SV Gel Clean-up (Promega). Sólo cuando se utilizó el producto directo de PCR se obtuvieron 19 colonias transformantes de las cuales 18 poseían el inserto. En tres de cuatro colonias analizadas por PCR, se determinó la correcta orientación del fragmento.En base a la optimización mencionada del método se clonó el gen correspondiente a N de la cepa XJCl3 de JUNV. El clonado en pLenti6/V5 TOPO generó 9 colonias transformantes, de las cuales 7 poseían el inserto de interés. Se seleccionaron 4 de estas colonias para verificar la orientación correcta del fragmento, siendo 3 de ellas positivas. De la metodología expuesta, dos pasos resultan críticos: el aislamiento del ARN y la amplificación del fragmento utilizando los primers modificados para su inserción en pLenti6/V5 TOPO. La optimización de estos pasos se logró, en el primer caso, mediante el reemplazo del fenol-cloroformo por columna de sílica y en el segundo, utilizando como molde del ADN clonado en pGEM-T-Easy. Estas optimizaciones permitieron a su vez el clonado de N de XJCl3, cepa que por presentar niveles de multiplicación in vitro inferiores a IV4454, dificulta el aislamiento de suficiente cantidad de ARN viral.