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Los cultivos celulares persistentemente infectados con virus Junín (JUNV), agente productor del "mal de los rastrojos" se caracterizan por presentar una marcada resistencia a la sobreinfección con virus homólogo y con virus heterólogos antigénicamente relacionados con JUNV. La línea celular K3, obtenida por infección experimental de células BHK-21 con la cepa atenuada XJCl3 de JUNV, resultó resistente a la sobreinfección con JUNV, virus Tacaribe (TCRV) y susceptible frente a los siguientes virus: de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), Pichindé (PICV), herpes simplex 1 (HSV-1) y de la estomatitis vesicular (VSV). En el caso de la sobreinfección de K3 con JUNV y TCRV, el escaso nivel de infectividad producido se detectó asociado a células mientras que en la infección realizada en células BHK-21 se detectaron altos títulos de infectividad tanto en el sobrenadante del cultivo como así también asociado a células. La sobreinfección de K3 con JUNV o TCRV no aumentó los niveles de producción de la nucleoproteína viral (N) ni de la principal glicoproteína de envoltura (G1) de JUNV detectados en K3 rutinariamente. JUNV y TCRV fueron capaces de adsorberse y penetrar en K3 aunque menos eficientemente que en BHK-21. La síntesis de ARN antigenómico en K3 sobreinfectadas con TCRV resultó incluso más rápida que en BHK-21. En base a los antecedentes mencionados que sugieren que un bloqueo en las etapas tempranas del ciclo de multiplicación viral no sería el responsable directo de la resistencia a la sobreinfección, se planteó el objetivo de este trabajo enfocando los estudios de resistencia a la sobreinfección al análisis de la producción de viriones luego de la sobreinfección con énfasis en las etapas de ensamblaje y brotación. A este fin se estudió en primer lugar la formación de pseudotipos en células K3 sobreinfectadas con TCRV. Para ello, el virus cosechado a partir de este sistema se neutralizó con suero anti-JUNV o anti-TCRV, la fracción de virus no neutralizado se creció en células Vero para analizar la presencia ARN viral utilizando primers especificos para dichos virus mediante una RT-PCR. Así se determinó que las células K3 sobreinfectadas con TCRV producen viriones con genoma/envoltura: TCRV/TCRV, JUNV/JUNV pero no así JUNV/TCRV. A continuación se estudió la presencia del factor TSG-101, proteína involucrada en el tráfico de proteínas desde y hacia la membrana plasmática y participante en el proceso de brotación viral, en células K3, BHK-21, BHK-21 infectadas con JUNV y K3 sobreinfectadas con JUNV mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) y western blot (WB). Todos los cultivos presentaron por IFI el patrón de expresión endosomal típico de esta proteína, sin embargo, la cantidad de TSG-101 fue significativamente mayor en el caso de las células K3, sobreinfectadas o no, resultados comprobados también por WB. Por último se realizó una microscopía electrónica de estos cultivos observándose en el caso de las células BHK-21 infectadas con JUNV la presencia de viriones pleomórficos extracelulares de 50-80 nm, mientras que en K3 y en K3 sobreinfectadas con JUNV se observó escasa cantidad de viriones extracelulares. La mayoría de los viriones se encontraron asociados a la membrana plasmática (MP), observándose también estructuras tubulares aberrantes de 100 a 400 nm de longitud asociadas a la MP. Conclusiones Estos resultados permiten concluir que si bien el nivel reducido de la síntesis de antígenos virales sería uno de los factores clave en la disminución de la infectividad producida en células K3 sobreinfectadas con JUNV, aparecería asociado a este mecanismo el control de la brotación del virus sobreinfectante mediante la sobre-producción de TSG101 en dichas células. Así se explicaría también la susceptibilidad de K3 frente a LCMV, PICV, HSV y VSV que no utilizan TSG-101 en su brotación.

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