La ceramida promueve la muerte de los fotorreceptores a través de una vía caspasa independiente.

PRADO SPALM FH; VERA M; POLITI LE; ROTSTEIN NP

Buenos Aires

Congreso; XI Reunión Anual AIVO- II Reunión conjunta AIVO-BRAVO; 2016

Asociación Investigación en Visión y Oftalmología

La ceramida promueve la muerte de los fotorreceptores a través de una vía caspasa independiente. Prado Spalm FH., Vera MS., Politi LE, y Rotstein NP.Instituto de Investigaciones Bioquímicas, Depto. Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur-CONICET, Bahía Blanca, Argentina. facu_prado@hotmail.comCeramide promotes photoreceptor death through a caspase-independent pathway.Objetivos: la muerte por apoptosis de los fotorreceptores (FR) es un factor común en muchas de las enfermedades neurodegenerativas de la retina. Investigar los mecanismos y mediadores moleculares de dicha muerte resulta entonces un adecuado enfoque en la búsqueda de futuros tratamientos. Nuestro laboratorio demostró que la ceramida (Cer) induce la muerte de FR en cultivo y que el ácido docosahexaenoico (DHA) protege frente a dicho daño. En este trabajo nos propusimos investigar los mecanismos moleculares que median la inducción de muerte por Cer de los FR en cultivo.Métodos: cultivos neuronales puros de retina de rata se trataron con o sin 10 µM C2-Ceramida (C2-Cer) y después de 6 hs. se evaluaron distintos marcadores y vías de la apoptosis. Se analizó la integridad nuclear con la sonda DAPI, la fragmentación del DNA mediante ensayo de TUNEL, la preservación del potencial de membrana mitocondrial con Mitotracker, y la viabilidad celular por ensayo de MTT. Se investigó el efecto de C2-Cer sobre la vía de Erk/MAPK, por Western blot con anticuerpos específicos. Para analizar si Cer activaba a las caspasas, se evaluó la activación de caspasa-3 por inmunocitoquímica y se pretrataron los cultivos con z-vad-fmk, un pan inhibidor de caspasas, antes de agregar C2-Cer. Para investigar la participación de catepsinas y/o calpaínas, se agregó ALLN, un pan inhibidor de ambas proteasas, previo a la C2-Cer. Resultados: La C2-Cer indujo la muerte de los FR, con incremento de núcleos picnóticos del 10 al 50%. Controversialmente, el ensayo de TUNEL no mostró que C2-Cer aumentara la fragmentación internucleosomal del DNA en los FR aún después de 15 hs. La C2-Cer indujo una rápida disminución de P-Erk, a los 30 y 60 min de su agregado. La disminución de un 40% en la viabilidad (MTT) y de los FR que preservaban el potencial de membrana mitocondrial sugirió que C2Cer afectaría a las mitocondrias, aunque sin desencadenar la activación de las caspasas, ya que no se observaron FR que expresaran caspasa-3 clivada y el agregado de z-vad-fmk no frenó la muerte. Por su parte, la pre-incubación con ALLN disminuyó significativamente dicha muerte sugiriendo un rol clave de las catepsinas y/o calpaínas. Conclusiones: la Cer induciría la muerte por apoptosis de los fotorreceptores a través de un mecanismo caspasa-independiente que involucraría a catepsinas y/o calpaínas. Financiación: ANPCyT, CONICET y SECyT-UNS.