MicroARNs en endoparásitos zoonóticos

MACCHIAROLI N; ROSENZVIT M C

Temas de Zoonosis VI

ASOCIACION ARGENTINA DE ZOONOSIS

Año: 2014; p. 1 - 300

MicroARNs en endoparásitos zoonóticos Natalia Macchiaroli y Mara Rosenzvit 1. INTRODUCCIÓN Las zoonosis causadas por protozoos y helmintos constituyen importantes problemas en la salud pública y la economía mundiales. Dentro de los protozoos zoonóticos se encuentran Giardia lamblia, Toxoplasma gondii y Trypanosoma cruzi, entre otros. El término parásitos helmintos es operacional y comprende parásitos nematodes, como Ascaris spp. y platelmintos, como los trematodes de Schistosoma spp y los cestodes como Echinococcus spp. Los microARN son una clase de pequeños ARN no codificantes de ~22 nucleótidos (nt) de longitud, que poseen un rol fundamental en la regulación de la expresión genética. Los microARN inhiben la expresión genética post-transcripcionalmente por unión al ARN mensajero (ARNm) de sus genes blanco promoviendo su degradación, desestabilización o represión traduccional (Figura 1a). La importancia de los microARN en procesos biológicos clave tales como el desarrollo, proliferación celular y metabolismo ha sido ampliamente documentada1. Hasta el momento se han reportado más de 25000 microARNs en 193 especies de animales y plantas. Cada microARN tiene la capacidad de unirse y regular cientos de ARNm, habiéndose mostrado que algunos microARN tales como miR-1 o miR-124 son capaces de cambiar el perfil celular completo de ARNm, definiendo por lo tanto el destino celular. Estas características sugieren que los microARN son reguladores maestros de la expresión genética. Dado que la regulación de cada microARN sobre cada gen es a menudo sutil, y que cada ARNm puede ser regulado por más de un microARN se considera que estos pequeños ARN realizan una regulación fina de la expresión genética permitiendo una respuesta rápida a los cambios ambientales. Los protozoos y helmintos necesitan este tipo de regulación genética para poder contar con los repertorios apropiados de proteínas que les permitan invadir, migrar y establecerse en sus hospederos, sobrevivir a la respuesta inmune ejercida por los mismos, y desarrollarse a diferentes estadios del ciclo de vida. Por lo tanto, la regulación ejercida por los microARN podría jugar un rol esencial para el desarrollo y la adaptación de los parásitos a sus hospederos. En este capítulo vamos a discutir sobre la maquinaria proteica implicada en la síntesis y la función de los microARN de los endoparásitos. Asimismo, revisaremos la identificación y los primeros intentos de elucidar el rol de estos pequeños ARN silenciadores en el parasitismo. 2. LA MAQUINARIA DE microARNs En la vía canónica, los microARN son generados a partir de precursores largos con estructura de tallo y rulo denominados microARN primarios (pri-microARNs) que se transcriben del genoma. En el núcleo, la enzima Drosha genera un precursor de ~70 nt (pre-microARN) que es exportado hacia el citoplasma por Exportina-5, donde es clivado por la enzima Dicer, generando un dúplex que comprende el microARN maduro y su cadena parcialmente complementaria (microARN*). El microARN maduro es unido a un complejo efector que contiene un miembro de la familia de proteínas Argonauta (Ago). El microARN ensamblado en este complejo efector se asocia luego con una secuencia blanco ubicada generalmente en la región 3? no traducida (3?UTR) del ARNm blanco. Si la complementariedad entre el microARN y el ARNm blanco es total, se produce la ruptura endonucleolítica de este último. Si la complementariedad es parcial, como ocurre generalmente en animales, se produce la inhibición de la traducción o desestabilización del ARNm. En animales, la mayoría de los microARN se unen a sus blancos a través de los nt 2?8, región denominada ?secuencia de siembra?. Existen dos vías adicionales para la biogénesis de microARNs en animales: la vía independiente de Drosha y la independiente de Dicer2. En la vía independiente de Drosha los microARN pueden generarse a partir de intrones de genes codificantes o de pequeños ARNs nucleolares (snoRNA), entre otros (Figura 2). 2.1. LA MAQUINARIA DE microARNs EN PROTOZOOS La maquinaria de microARNs es conocida en los protozoos G. lamblia y T. gondii. A pesar de que en G. lamblia no se han encontrado homólogos de Drosha, se han identificado un homólogo de Argonauta (GIAgo) y uno de Dicer (GIDicer) y se ha mostrado que los mismos son funcionales en este organismo3. El repertorio de microARNs de G. lamblia incluye aquellos derivados de snoRNA, por una vía independiente de Drosha, lo que está de acuerdo con las enzimas encontradas3. Podría especularse que durante la evolución de este parásito se ha priorizado la vía independiente de Drosha, quizás debido al menor requerimiento regulatorio y de enzimas en comparación con la vía canónica. El genoma de T. gondii codifica una proteína Dicer (TgDicer) y una proteína Ago (TgAgo), las cuales muestran una variabilidad significativa en cuanto a secuencia y organización de dominios respecto al consenso4. Más aún, los análisis filogenéticos mostraron que TgAgo pertenece a la familia de tipo Ago pero con poco soporte de método de remuestreo (?bootstrap?), sugiriendo que la proteína divirgió significativamente de sus contrapartes de metazoos y de plantas4. En los genomas de algunos otros protozoos no se encontraron genes codificantes para proteínas tipo Ago ni Dicer5. Entre éstos se encuentra T. cruzi, a pesar de que se han encontrado homólogos de estas proteínas para otras especies del mismo género como T. brucei5. Por lo tanto, no todos los protozoos poseen la vía de regulación por microARN. 2.2. LA MAQUINARIA DE microARNs EN HELMINTOS Hasta el momento, se han encontrado las proteínas de la maquinaria de microARN en todos los helmintos estudiados. Se ha reportado la presencia de genes de la vía, como Dicer y Drosha y de genes tipo Ago tanto en S. japonicum como en S. mansoni, lo que sugiere que poseen un sistema funcional de microARNs. En el parásito nematode Ascaris, se identificaron genes que codifican 10 proteínas Ago así como otras proteínas de la vía. Recientemente, el análisis de genómica comparativa de cuatro especies de cestodes, Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, Hymenolepis microstoma y Taenia solium reveló que además de las Agos canónicas, éstos poseen un nuevo clado significativamente divergente de otros clados Ago ya descriptos6. Estas últimas proteínas divergentes están ausentes en los platelmintos de vida libre tales como Schmidtea mediterranea, sugiriendo que podrían tener un rol en el parasitismo. 3. IDENTIFICACIÓN DE microARNs EN ENDOPARÁSITOS A pesar de que la explosión en el aislamiento y la identificación de microARNs comenzó a principios de los años 2000, no fue sino hasta el año 2006 en que los primeros microARN de endoparásitos eucariotas de animales comenzaron a ser identificados (ver Tablas 1 y 2). Desde entonces, numerosos reportes que abarcan diferentes filos han sido publicados. Por ejemplo, se ha utilizado un análisis basado en homología para identificar microARNs candidatos conservados en S. mansoni7. Un enfoque experimental basado en el clonado a baja escala fue utilizado para identificar microARNs en E. granulosus8. Este último abordaje permitió la identificación de microARNs conservados, algunos de los cuales son conocidos por su papel fundamental en el desarrollo de otros organismos, como así también de nuevos microARNs no reportados en otros organismos hasta el momento. En la actualidad, hay una visión bastante completa del repertorio de microARNs en protozoos y helmintos, observándose que la regulación post-transcripcional mediada por estos pequeños ARN silenciadores parecería ser una característica común para algunos protozoos y para todos los helmintos estudiados hasta el momento (Tablas 1 y 2). 3.1. MicroARNs EN PROTOZOOS Los reportes de microARNs en protozoos zoonóticos se resumen en la Tabla 1. En el protozoo G. lamblia, un número de microARNs se originan a partir de precursores de snoRNA (ver ítem 2.1). Se ha demostrado que dependen de GIDicer para la biogénesis y de GIAgo para la regulación de la expresión genética3. En el protozoo T. gondii, a pesar de que las proteínas de la maquinaria de microARN difiere de la de metazoos, los pre-microARN y los microARN maduros presentan características similares a las de los microARNs animales4. Hasta el momento, a diferencia de lo que ocurre en helmintos, la mayoría de las secuencias de microARNs de protozoos no poseen homólogos entre las secuencias reportadas de otros organismos3, 4 (de acuerdo a miRBase, versión 19). 3.2. microARNs EN HELMINTOS Se han identificado microARNs para un gran número de helmintos zoonóticos, incluyendo nematodes, trematodes y cestodes (Tabla 2). Entre estos microARNs se encuentran tanto microARNs conservados a lo largo de la evolución, como específicos de género o especie. Algunos microARNs, tales como miR-71, se encuentran altamente expresados en varias especies tales como Brugia pahangi9, Schistosoma japonicum, E. granulosus y E. multilocularis8. Esto último también fue recientemente observado por secuenciación paralela masiva de pequeños ARNs (Macchiaroli et al., resultados no publicados; Cucher et al., resultados no publicados). Para varios helmintos, se demostró que los microARNs presentan expresión diferencial de acuerdo al estadio del parásito. Por ejemplo, en E. granulosus, que posee una notable plasticidad en el desarrollo, un número de microARNs conservados se encontraron diferencialmente expresados entre los estadios de quiste (metacestode) y pre-adulto (protoescólex), sugiriendo que los microARN podrían tener un rol en el desarrollo del parásito8. Es interesante destacar que los microARN de nematodos muestran una mayor conservación de secuencia que los de platelmintos, con un 100% de identidad en las secuencias de microARN conservadas como let-7, miR-1, miR-9 y miR-71. Sin embargo, para todos los helmintos estudiados hasta el momento también se han identificado microARNs nuevos, algunos de los cuales fueron validados experimentalmente. Así, los endoparásitos no sólo exhiben particularidades en la maquinaria sino también en el repertorio de microARNs. 4. ¿CUÁL ES LA FUNCIÓN DE LOS microARN EN LOS ENDOPARÁSITOS? Los microARN ejercen la regulación post-transcripcional de la expresión genética guiando al complejo efector hacia el ARNm blanco. Teniendo en cuenta este modo de acción, es esencial identificar el/los blanco/s de un microARN con el fin de revelar su/s función/es. Los microARN de animales se unen a sus blancos por complementariedad parcial a una secuencia corta (generalmente 6-7 nt). La búsqueda de una secuencia complementaria tan corta en los ARNm llevará a obtener predicciones falso-positivas. La tarea se complica aún más porque cada microARN puede regular cientos de genes, la regulación negativa de la expresión genética suele ser sutil, y por el hecho de que las reglas de unión al ARNm blanco no están completamente claras. Para numerosos parásitos que poseen ciclos de vida complejos y que son difíciles de reproducir en el laboratorio, surgen más dificultades debido a la limitada disponibilidad de material parasitario, la falta de sistemas in vitro e in vivo apropiados, la falta de disponibilidad de genomas anotados y/o de datos masivos de expresión, la ausencia de protocolos de transfección y de silenciamiento y la escasez de anticuerpos y de microarreglos comercialmente disponibles. Además, debido a que estos parásitos son causa de enfermedades desatendidas en países en vías de desarrollo, hay en general pocos recursos económicos disponibles para su investigación. 4.1. BLANCOS DE microARNs EN PROTOZOOS A pesar de que se han identificado numerosos microARNs para protozoos y helmintos (tablas 1 y 2), se identificaron blancos sólo para unos pocos de ellos. Por ejemplo, se realizó una búsqueda de ARNm blanco en G. lamblia para un pequeño número de microARNs, encontrándose que una proporción de los blancos candidatos correspondieron a proteínas variables de superficie (VSPs, del inglés ?variant surface proteins?). Dado que la expresión de una única VSP en la superficie de G. lamblia está relacionada con la evasión de la respuesta inmune del hospedero, se eligieron las VSPs para análisis experimentales posteriores. Los resultados obtenidos sugirieron la participación del mecanismo mediado por microARNs en el control de la expresión de las VSPs3. 4.2. BLANCOS DE microARNs EN HELMINTOS La identificación de blancos de microARNs en helmintos se ha realizado sólo por métodos bioinformáticos. La búsqueda de probables genes blanco en S. japonicum mostró que cada microARN podría regular a numerosos genes, y además que algunos genes relacionados con el desarrollo podrían estar regulados por numerosos microARNs. Por ejemplo, el receptor de TGF-β, que juega un rol importante en el desarrollo de Schistosoma spp., podría ser regulado por 16 microARNs, incluyendo a let-7, un microARN muy conocido por su rol en la regulación temporal del desarrollo de C. elegans. En S. mansoni la identificación bioinformática de blancos mostró que el microARN miR-71 tuvo el mayor número de blancos comparado con otros microARN, ya que regularía 42 genes blanco diferentes7, en coincidencia con lo observado por Cucher et al. (resultados no publicados) en Echinococcus spp. Por otro lado, varios de los genes blanco de los microARN de S. mansoni podrían estar regulados por más de un microARN. Además, varios microARN tienen múltiples sitios blanco dentro del mismo gen. Estas dos características también se han observado en Echinococcus spp. por Cucher et al (resultados no publicados). Por estudios en los organismos modelo, se sabe que un mismo ARNm puede ser inhibido de manera conjunta por más de un microARN (Figura 1b). Asimismo, cada microARN puede inhibir la expresión de distintos ARNm blanco (Figura 1c). El panorama es aún más complejo dado que un único ARNm puede tener múltiples sitios blanco para un mismo microARN. Los resultados aquí descriptos mostraron que esto puede pasar también entre los helmintos parásitos, sugiriendo que los microARN podrían estar involucrados en redes regulatorias de la expresión genética en parásitos. 5. CONCLUSIÓN La regulación mediada por microARNs está comenzando a ser descifrada en protozoos y helmintos parásitos. Hasta el momento, se ha demostrado que algunas de las características de la maquinaria y el repertorio de microARNs de endoparásitos son específicas, dado que difieren de las del hospedero. Para algunos protozoos y para todos los helmintos analizados hasta el momento, los patrones de expresión y abundancia de microARNs sugieren funciones importantes en la biología de estos parásitos. A pesar de que se necesitan más investigaciones para conocer los blancos de los microARN en parásitos, algunos de los estudios que identificaron genes blanco en estos organismos sugirieron que los microARN participan en procesos esenciales, como el desarrollo y la evasión de la respuesta inmune del hospedero. Los avances esperados en los proyectos genómicos, transcriptómicos y de genómica funcional para estos organismos llevarán a un conocimiento más profundo de los microARN y de las vías que ellos regulan. Esto a su vez proporcionará nuevas estrategias de diagnóstico e intervención para las enfermedades devastadoras que producen los parásitos. El potencial diagnóstico de los microARNs en zoonosis parasitarias ha sido descripto recientemente para S. japonicum10. 6. REFERENCIAS 1.Bartel DP. 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