PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES BOVINOS UTILIZANDO ESPERMATOZOIDES SELECCIONADOS POR AFINIDAD CON APTAMEROS ASOCIADOS A NANOPARTÍCULAS

VICHERA GABRIEL; VERONICA FARINI; CAMAÑO CARLA; PERANDONES CLAUDIA; VIALE DL; YBARRA GABRIEL; RADRIZZANI MARTIN

Buenos Aires

Congreso; 2° congreso de la Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias (SATE) 2014; 2014

Sociedad Argentina de Tecnologías Embrionarias (SATE)

Los procedimientos de criopreservación de semen bovino generan daños y alteraciones en las membranas plasmáticas de un gran número de espermatozoides, provocando la disminución de su capacidad fecundante e incluso la apoptosis. Se ha demostrado que los espermatozoides en proceso de apoptosis expresan Fosfatidil-Serina en su superficie. En este trabajo se utilizaron aptámeros de ADN capaces de reconocer con alta afinidad y selectividad la Fosfatidil-Serina de espermatozoides apoptoticos, estos aptameros fueron derivatizados con nanopartículas magnéticas y evaluados en columnas súper-para-magnéticas optimizadas para separar espermatozoides bovinos en proceso de apoptósis. Con el objetivo de determinar si existe un efecto de este procedimiento de selección en la capacidad fecundante de los espermatozoides, hemos evaluado las tasas de desarrollo in vitro de embriones generados por FIV con espermatozoides sexados o no, utilizando como control el método convencional de selección espermática mediante gradiente de Percoll. Para realizar este trabajo, complejos ovocito-cúmulus (COCs) fueron colectados de ovarios obtenidos de matadero y madurados in vitro a 39ºC en atmósfera húmeda y 5% de CO2 durante 24 h. Los COCs madurados fueron depositados en medio Fert-TALP suplementado con 0.5 mg/ml de Hipotaurina y 20 UI/ml de heparina. Semen bovino sexado o no, fue descongelado en agua a 37°C por 30 s. El semen fue centrifugado a 700 g por 15 min en gradiente de percoll o se incubaron durante 15 min a 37º C con 10 uM de aptámeros sintéticos marcados con 5´-Biotina más el agregado 100 ul de microesferas magnéticas recubiertas con estreptoavidina comercial. Después de 15 min de incubación a 37ºC las partículas fueron capturadas, se recuperaron los sobrenadantes con los espermatozoides no unidos y se concentraron por centrifugación. Posteriormente el precipitado fue resuspendido en medio Fert-TALP. Los ovocitos se co-incubaron con una concentración final de 2-4 millones de espermatozoides/ml a 39°C con una atmósfera de 5% CO2 en aire. Luego de 18 h de co-incubacion los presuntos cigotos fueron cultivados en gotas de 100 μl de medio SOF suplementado con 2,5% de SFB, en una atmósfera humidificada de 5% O a 39ºC. A día 2 de cultivo se cambió el 50 % del medio de cultivo y a día 5 el medio fue suplementado con 10% SFB. Se evaluó el Nº de embriones clivados a las 48 h y el  Nº de blastocistos y blastocistos expandidos a día 7 post FIV. Los resultados de desarrollo se analizaron mediante Fisher p<0,05 y se presentan en la Tabla 1. No se observaron diferencias estadísticas en las tasas de clivaje ni en las tasas de blastocistos entre los grupos de embriones producidos tanto con semen sexado o no, en ambos procedimientos de selección espermática. Nuestros resultados indican que la selección espermática utilizando el sistema de afinidad a aptámeros asociados a nanopartículas no afecta el desarrollo embrionario al realizar procedimientos de fertilización in vitro. Demostrando que la tecnología de aptámeros asociados a nanopartículas puede ser aplicada en la mejora de producción de embriones bovinos.Tabla 1.Método de Selección Semen Sexado n Embriones Clivados Blastocistos(%) Percoll - 131 113 (86.3) 33 (25.2) 22 (16.8)Aptameros-+ 31 23 (74.1) 6 (19.4) 2 (6.5) Nanopartículas  (a,b,c,d) Valores con diferentes superíndices en una columna son significativamente diferentes (P<0,05, test de Fisher). +, Positivo; -,121 97 (80.2) 26 (21.5) 24 (19.8) negativo.- + 26 21 (80.8) 5 (19.2) 2 (7.8)