Puesta a punto de una plataforma de microarreglos de ADN

MARIANO SALIBE; MARIANO ALVAREZ; DANIELA CELI; CINTIA SERRA; FERNANDO PITOSSI; OSVALDO PODHAJCER

Mar del Plata, Argentina

Congreso; L Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2005

El análisis de la transcripción de genes a través del uso de los Microarreglos de ADN es una herramienta fundamental para el estudio de la Genómica Funcional. El uso de esta tecnología requiere la optimización de todos los pasos involucrados en el proceso de la obtención de datos. Existen protocolos alternativos para cada una de estas etapas con gran influencia en el resultado final. El objetivo de este trabajo fue estudiar minuciosamente las diversas alternativas en cada una de estas etapas, para maximizar la calidad de los datos obtenidos. En este trabajo se describen las variables mas importantes para, la impresión de los microarreglos, la marcación de las secuencias blanco, la amplificación de ARN y la hibridización. El resultado fue digitalizado mediante un escáner confocal. Los datos obtenidos fueron normalizados mediante distintos métodos incluyendo uno desarrollado en nuestro laboratorio. Los diseños experimentales fueron analizados mediante diferentes métodos estadísticos: prueba de t-student y SAM (Statistical Analysis of Microarrays), ANOVA y limma (Linear models for Microarray Data). Finalmente utilizamos métodos de clasificación supervisada y no supervisada (análisis de clusters jerárquico) para evaluar la presencia de firmas moleculares que serán discutidos en la presentación   Conclusiones La combinación de DMSO 50% como buffer de impresión sobre una superficie de aminosilano a una humedad relativa entre 45-50% fue la que generó spots de mejor calidad. La obtención de secuencias blanco marcadas puede ser realizada tanto a partir de ARN Total como de ARN poly A+, sin que se vea afectada la calidad de las mismas. El rango dinámico es maximizado, al hacer digitalizaciones sucesivas sobre el mismo microarreglo, variando en cada una de ellas la sensiblidad del equipo. El método de normalización mas eficiente resultó ser el 3D, desarrollado en nuestro laboratorio. Es indispensable un diseño correcto de ?Dye Swap? para garantizar la calidad en el resultado final del experimento.