Interacción de diferentes cepas de Bacillus cereus con macrófagos peritoneales

RACEDO, S., ROLNY, I. Y PÉREZ, P. F.

Córdoba

Congreso; XI Congreso Argentino de Microbiología; 2007

La virulencia de <i>Bacillus cereus</i> es multifactorial y se han demostrado diversos efectos biológicos en enterocitos humanos en cultivo (Caco-2) varían según la cepa. La interacción de estos microorganismos con células fagocíticas profesionales, tales como los macrófagos peritoneales (MQ), es poco conocida. El objetivo de este trabajo fue evaluar  la interacción de las cepas M2, T1, B10502 y 2 de B. cereus  con MQ de ratones BalbC. Los MQ fueron extraídos de la cavidad peritoneal de ratones de seis semanas de edad con solución fisiológica adicionada con albúmina (0,1%) y heparina (0,3%), la suspensión celular fue centrifugada 10 min a 2500 rpm y el pellet fue resuspendido en RPMI con suero bovino fetal (SBF) (10%). Se realizó el recuento celular por métodos hemocitométricos. Se emplearon 200 ul de una suspensión de 10 exp 6 MQ/ml los cuales fueron infectados con las cepas de B. cereus opsonizadas con SBF (MOI=1:20) y marcadas con 5(6) carboxifluoresceina diacetato succinimidil éster (CFSE; 25 µM). Se realizaron los siguientes estudios: a) Cinética de muerte celular: se  determinaron las UFC/ml  a diferentes tiempos post-infección, para ello los MQ fueron lavados 2 veces con buffer fosfato (PBS) y las células fueron lisadas con agua destilada estéril, diluciones apropiadas fueron plaqueadas en  agar nutritivo e incubadas 16 hs a 37ºC. b) Coloración con naranja de acridina: los MQ infectados fueron centrifugados y luego fijados con etanol absoluto 5 min/0ºC, lavados con PBS y coloreados con naranja de acridina (0,5 µg/ml), las preparaciones citológicas fueron evaluadas por microscopía de fluorescencia. c) Ensayo de fagocitosis por citometría de flujo: se evaluó el porcentaje de microorganismos internalizados a diferentes tiempos post-infección . La fluorescencia de las bacterias extracelulares fue apantallada con azul tripán. d) Colocalización de B. cereus marcado con CFSE en lisosomas tardíos, para ello los MQ infectados fueron lavados y resuspendidos en un buffer de homogeinización con inhibidores de proteasas,  las células fueron lisadas por pasajes sucesivos por aguja, el homogenato fue centrifugado para eliminar los detritus celulares y núcleos, y obtener la fracción post-nuclear (FPN). La FPN fue marcada con anti-LAMP-1 marcado con ficoeritrina. Las muestras para citometría fueron adquiridas en un FACScalibur. Las cepas B10502 y M2  fueron rápidamente depuradas por los MQ peritoneales comparado con las otras cepas. El número de microorganismos sobrevivientes fue: B10502: 2,5 ± 3,5; M2: 27,5 ± 2,1; T1:109,5 ± 19,1; 2: 97 ± 2,8 UFC en el lisado. Estos resultados estuvieron relacionados con el mayor porcentaje de bacterias fagocitadas y asociadas observado para B. cereus B10502 y M2 determinados por citometría de flujo (B10502: 39% y M2: 17%) y por tinción con naranja de acridina (B10502:51,4% y M2:30%), respectivamente. Estas cepas mostraron un mayor porcentaje de microorganismos en lisosomas tardíos (B10502: 40,30% y M2: 39,47%).   Estos resultados agregan una nueva dimensión al estudio de los factores de virulencia de Bacillus cereus y muestran que la variabilidad de los efectos biológicos asociados a este microorganismo podrían estar relacionadas con diferentes patrones de interacción con las células fagocíticas profesionales.