Método combinado de extracción de ADN genómico a partir de semen bovino.

BRIGNONE, SG,; MENA CJ; GARRO A,; CHIAPPELO LS; RAVETTI S,; PALMA SD.

Cordoba

Congreso; LII Reunión Anual de la Asociación Argentina de Farmacología Experimental (AAFE 2020).; 2020

AAFE

Tantolos estudios genómicos como los epigenómicos del ADN espermáticoconstituyen una herramienta fundamental para las investigacionesbiológicas, la ingeniería genética y la práctica reproductivaclínica.La extracción de ADN a partir de semen presentadesafíos únicos (debido a una barrera rica en enlaces disulfuro yuna compactación de la cromatina del espermatozoide) en comparacióncon la extracción de ADN delas células somáticas. La idiosincrasia de estas células haploideshace necesario el uso de métodos no convencionalesde extracción de ADN.Elobjetivo de este trabajo radicó en combinar un protocolo específicode extracción de ADN deesperma de mamíferos (protocolo original (PO)- Weyrich, A. (2012))junto a un protocolo basado en columnas comerciales (DNeasy Blood &Tissue Kits ? QIAGEN), con la intención de obtener materialgenético de alta calidad (óptimo rendimiento, pureza aceptable yadecuada integridad del ADN).Pararealizar la extracción seutilizó pajuelas criopreservadas de semen bovino dela empresa ABS Argentina. Todo el proceso se realizó bajoesterilidad.La muestra de semen fuesometida, en primer lugar, a un proceso de centrifugación, el cualpermitió eliminar el fluido seminal. El pellet de células obtenidose lavó con buffer salino (Phosphate-buffered saline-PBS).Posteriormente, las células fueron sometidas a un proceso de lisis,en el cual se utilizaron concentraciones mayores de tritón-X100,ditiotreitol (DTT) y proteinasa K comparadas con las usadas en el PO.La mezcla fue incubada durante una noche a 50°C. Por último, parala purificación y precipitación del ADN seutilizó el Kit QIAGEN.La calidad y concentracióndel ADN extraídose determinó mediante espectrofotometría con luz UV. Por otro lado,la integridad del ADN fueevaluada a partir degeles de agarosa. Se realizó también reacciones en cadena de lapolimerasa (PCR).En comparación con el PO, los resultadosobtenidos a partir del método combinado fueronmás prometedores. La concentración de ADN=(PO):112ng/µL-no confiable debido a la presencia de compuestosaromáticos; (método combinado):8,98ng/µL; relación 260/280 nm= (PO) <1,6; (método combinado)> 1,6.Enconclusión, este método combinado de extracción de ADN puedeser utilizado de forma independiente o como parte de un flujo detrabajo continuo adaptado, ya que permite obtener material genéticode adecuada calidad.p { margin-bottom: 0.25cm; direction: ltr; line-height: 115%; text-align: left; orphans: 2; widows: 2; background: transparent }